Optical tweezers combined with fluorescence microscopy and a heating laser for the study of model lipid bilayer systems and membrane proteins

Abstract

In the past decades, optical tweezers have been an exquisite tool to study a variety of molecular machines. By studying mechanical properties of these biomolecules, it has been possible gain new insights into a range of biophysical questions regarding, for example, microtubule dynamics, the stepping behaviour of motor proteins, DNA mechanics, as well as, membrane remodelling. Membrane remodelling is important for many essential cellular processes such as cell division, vesicular transport of cargo, formation of lopodia and fission and fusion of the mitochondrial network. A cell's plasma membrane encloses the cytosol and defines its boundary to the extracellular environment. Any interaction between the cell and the environment is mediated either by membrane transport proteins or a change of membrane shape resulting, for instance, in an exchange of cargo via endo- or exocytosis. Deformations in the shape of the whole cell are predominately mediated by the cytoskeleton, whereas deformations during endo- and exocytosis are mediated by a shape change of the plasma membrane and its associated proteins. To regulate these mechanisms of membrane transport and deformation, cells developed several fundamental processes. One such essential process is the intracellular transport of membrane proteins or soluble components via vesicles. These vesicles form out of a at membrane and initially remain in contact with the original membrane through a tether. This reshaping of a membrane has been studied with a variety of in vitro membrane systems such as giant unilamellar vesicles utilizing optical tweezers. How an individual protein or oligomer induces this membrane deformation remains poorly understood. To study the mechanics of membrane remodeling, I established an in vitro assay of a reconstituted hemispherical giant unilamellar vesicle. In the experiment, a membrane tether is pulled out of a vesicle and interactions with membrane associated proteins can be observed. Here, dynamin related protein 1 (DRP1) was shown to sever membrane tethers after diffusion on the model membrane system. To perform these experiments, I developed an optical tweezers system that is capable of simultaneous force and uorescence measurements. The system is further equipped with simultaneous interference reection microscopy and a heating laser that can locally increase the temperature, for example, to adjust the membrane tension of vesicles. Furthermore, a novel vibration isolation system and advanced temperature control minimized mechanical noise and thermal drift, respectively. The novel, custom-built microscope with single-molecule sensitivity allows to correlate membrane deformation with the presence of individual proteins or oligomers. In the long-term, such experiments will provide a better understanding of how proteins deform membranes to fullfill their cellular functions.

In den letzten Jahrzehnten haben sich optische Pinzetten als ein hervorragendes Werkzeug zur Untersuchung einer Vielzahl molekularer Maschinen etabliert. Durch die Untersuchung der mechanischen Eigenschaften dieser Biomoleküle konnten neue Einblicke in eine Reihe von biophysikalischen Fragen ermöglicht werden, z.B. in Bezug auf die Mikrotubulusdynamik, das Schrittverhalten von Motorproteinen, die DNA-Mechanik sowie die Membranremodellierung. Die Remodellierung der Membran ist wichtig für viele wesentliche zelluläre Prozesse wie die Zellteilung, den Transport von Vesikeln, die Bildung von Filopodien oder das Abspalten und Fusionieren des mitochondrialen Netzwerks. Die Plasmamembran einer Zelle umschließt das Cytosol und definiert dessen Grenze zur extrazellulären Umgebung. Wechselwirkungen zwischen Zelle und Umwelt wird entweder durch Membrantransportproteine oder eine Veränderung der Membranform vermittelt z.B. durch Materialaustausch der Endo- oder Exozytose. Deformationen der Form der gesamten Zelle werden überwiegend durch das Zytoskelett vermittelt, wohingegen Deformationen während der Endo- und Exozytose durch eine Formänderungen der Plasmamembran und der damit verbundenen Proteine vermittelt werden. Um diese Mechanismen des Membrantransports und der Deformation zu kontrollieren, entwickelten die Zellen mehrere grundlegende Prozesse. Einer dieser essentiellen Prozesse ist der intrazelluläre Transport von Membranproteinen oder löslichen Komponenten über Vesikel. Diese Vesikel bilden sich aus einer flachen Membran und bleiben anfangs durch einen Membrantubus mit der ursprünglichen Membran in Kontakt. Diese Umformung einer Membran wurde mit einer Vielzahl von in vitro Membransystemen wie z.B. riesigen unilamellaren Vesikeln unter Verwendung einer optischen Pinzette untersucht. Wie ein einzelnes Protein oder Oligomer diese Membranverformung hervorruft, ist bisher nur unzureichend bekannt. Um die Mechanismen der Membranremodelierung zu untersuchen, habe ich ein in vitro Experiment für ein rekonstituiertes unilamellares Riesenvesikel in Form einer Halbkugel durchgeführt. In diesem Experiment wird ein Membrantubus aus dem Vesikel herausgezogen und Wechselwirkungen von dem Tubus mit membranassoziierten Proteinen können beobachtet werden. Ich konnte zeigen, dass Dynamin-Related Protein 1 (DRP1) nach Diffusion auf dem Modellmembransystem den Membrantubus trennen kann. Dieser Prozess ist für die Teilung von Mitochondrien und deren Instandthaltung wichtig. Um solche Experimente durchführen zu können, habe ich einen neuen experimentellen Aufbau entwickelt basierend auf einer optischen Pinzette, bei welchem gleichzeitige Kraft- und Fluoreszenzmessungen durchführbar sind. Das System ist weiterhin mit einem Interferenzreflexionsmikroskop und einem Heizlaser ausgestattet. Alle Methoden können simultan benutzt werden. Der Heizlaser kann die Temperatur lokal erhöhen, um beispielsweise die Membranspannung von Vesikeln einzustellen. Darüber hinaus haben ein neuartiges Vibrationsisolationssystem und eine sehr stabile Temperaturregelung mechanische Schwingungen bzw. thermische Drift des Systems minimiert. Dieses neuartige maßgeschneiderte Mikroskop, welches Einzelmolekülempindlichkeit hat, ermöglicht gleichzeitig die mechanische Membranverformung und die Lokalisisation einzelner Proteine oder Oligomere zu messen. Langfristig werden solche Experimente ein besseres Verständnis dafür liefern wie Proteine Membranen, deformieren um ihrer Zellfunktionen zu genügen.