Structural and Functional Characterization of PII and PII-like Proteins and their Network of Interactions

Abstract

The signaling transduction proteins of PII superfamily are one of the ancient and highly conserved protein families in nature and widely distributed in all domains of life. Canonical PII exerts it’s signaling function via the binding of small effector molecules, including ATP, ADP, and 2-oxoglutarate (2-OG). All cyanobacteria contain a PII homologue of the GlnB-type, which is involved in the regulation of nitrogen assimilation by binding to N-acetyl-L-glutamate kinase (NAGK), the key enzyme of arginine biosynthesis, and to PII-interacting protein X (PipX), the co-activator of the global nitrogen-trascription factor NtcA. The binding of PII to NAGK enhances NAGK activity and prevents arginine (Arg) feedback inhibition, thereby increasing the flux into the arginine pathway. Formation of the PII-PipX complex causes a deactivation of the NtcA regulon. In this study, we identified Lys58 to be a key residue for proper sensing/signaling function of cyanobacterial PII protein. Furthermore, this study provided the first biochemical characterization of red algal PII protein from Porphyra purpurea. Its properties represent an intermediary state between PII properties in Cyanobacteria and Chlorophyta. A comparison to Chlorophyta PII proteins showed that during later stages of evolution of Chlorophyta, the PII proteins diverged in their properties, becoming very heterogeneous with respect to ADP and to 2-OG binding, while only the binding of ATP in presence of 2-OG has been conserved. Further, we characterized the first metabolic adaptation strategies of colorless-nonphotosynthetic alga Polytomella parva, in comparison to closely related green-photosynthetic alga Chlamydomonas reinhardtii, in response to nitrogen starvation. Metabolome analysis revealed that P. parva accumulates higher amounts of TCA intermediates as well as arginine, glutamate and aspartate. Strikingly, the PII and NAGK proteins in P. parva have coevolved into a stable hetero-oligomeric complex, irrespective of effector molecules such that PII evolved into a subunit of NAGK. The PII-like proteins lack the canonical PII signature sequences but are structurally clearly related to classical PII proteins. Their functions, targets and regulatory responses are unknown. A close examination of available cyanobacteria genomes revealed several different PII-like proteins. In this study, we focused on two PII-like proteins in cyanobacteria namely: 1) SbtB protein, which is located in one operon next to sodium dependent bicarbonate transporter (SbtA) and 2) the divalent ion tolerance protein CutA. Biochemical and physiological studies showed that the SbtB protein is an important component of the cyanobacterial carbon concentration mechanism (CCM) for sensing the fluctuation levels of inorganic carbon (Ci) via binding to the secondary messenger cAMP. Also, we demonstrated that cyanobacterial CutA protein is not involved directly in heavy metal sensing. SbtB was revealed as the first protein of the PII superfamily, which specifically binds cAMP in addition to ATP, ADP and AMP. However, for CutA, no binding of effector molecules could be identified. I resolved the crystal structures of CutA (in apo form) and SbtB (in apo status and in complex with AMP and cAMP) proteins. The nucleotide-binding pocket of SbtB is located between the lateral cleft of two subunits, as in canonical PII proteins. Apparently, the trimeric core architectural principle of PII-like proteins of CutA and SbtB are widely distributed similar to the canonical PII core architecture. This clearly indicates that the proteins of the PII superfamily arose evolutionary from a common trimeric ancestor protein.

Die Signaltransduktionsproteine der PII-Superfamilie stellen eine der ältesten hochkonservierten Proteinfamilien dar und finden sich in allen Domänen des Lebens. Kanonische PII-Signalproteine üben ihre Funktion dadurch aus, dass sie als Effektormoleküle ATP, ADP und 2-Oxoglutarat (2-OG) binden. Alle bislang untersuchten Cyanobakterien enthalten PII-Homologe des GlnB-Typs. Es reguliert den zellulären Stickstoff-Stoffwechsel, indem es an die N-Acetyl-L-Glutamat-Kinase (NAGK, katalysiert den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt der Arginin-Biosynthese) sowie an das PII-Interacting Protein X (PipX, Co-Aktivator des globalen Stickstoff-Transkriptionsfaktors NtcA) bindet. Die Interaktion von PII mit NAGK führt zur Erhöhung der NAGK-Aktivität und unterbindet die hemmende Wirkung von Arginin auf NAGK, was letztlich zu einer verstärkten Produktion von Arginin führt. Die Bildung eines PII-PipX-Komplexes wiederum führt zur Deaktivierung des NtcA-Regulons. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass der Lys58-Rest eine Schlüsselrolle bei der Signaltransduktion des cyanobakteriellen PII spielt. Das PII-Protein aus der Rotalge Porphyra purpurea wurde erstmals biochemisch charakterisiert. Es stellt einen Übergangszustand zwischen den PII-Proteinen aus Cyanobakterien und Chlorophyta dar. Durch den Vergleich der sensorischen Eigenschaften des PII-Proteins aus Rotalgen mit PII-Proteinen aus verschiedenen Phyla oxygener phototropher Organismen (Cyanobakterien, Grünalgen und Moose) zeigte sich, dass die PII-Signaltransduktion in Rotalgen weitgehend der in Cyanobakterien gleicht, wohingegen sich die Eigenschaften der PII-Proteine im Laufe der Entwicklung der Chlorophyta verändert haben. So verhalten sie sich sehr heterogen bezüglich der Bindung von ADP und 2-OG, nur die Bindung von ATP in Gegenwart von 2-OG ist konserviert. Eine weitere Studie befasste sich mit der PII-Signaltransduktion in der nicht photosynthetisch aktiven Alge Polytomella parva im Vergleich zur nahe verwandten, Photosynthese betreibenden Alge Chlamydomonas reinhardtii. Metabolom-Daten zufolge akkumuliert P. parva TCA-Intermediate sowie Arginin, Glutamat und Aspartat. Ferner zeigte diese Studie dass sich im Lauf der P. parva Evolution PII und NAGK zu einem stabilen, heterooligomeren Komplex entwickelt haben hat, der nicht mehr durch Effektormoleküle dissoziiert wird. Dementsprechend kann PII in diesem Fall als Untereinheit von NAGK angesehen werden. PII-ähnliche Proteine ähneln strukturell den klassischen PII-Proteinen, besitzen aber nicht die kanonischen PII Signaturmotive. Bislang war nichts über ihre Funktionen, Interaktionspartner und regulatorischen Reaktionen bekannt. Eine in-silico Analyse der Genome von Cyanobakterien zeigte das Vorhandensein verschiedener PII-ähnlicher Proteine (PII-like proteins). Im Rahmen dieser Arbeit lag der Fokus auf zwei PII-ähnlichen Proteinen in Cyanobakterien: 1) SbtB, dessen Gen in einem Operon in direkter Nachbarschaft zum Natriumabhängigen Bicarbonat-Transporter (SbtA) liegt und 2) CutA (divalent ion tolerance protein). Es konnte sowohl biochemisch als auch physiologisch gezeigt werden, dass SbtB eine wichtige Komponente des Kohlenstoffanreichungsmechanismus (carbon concentration mechanism, CCM) ist, indem es Änderungen der intrazellulären Konzentration von anorganischem Kohlenstoff (Ci) durch Bindung des sekundären Messengers cAMP verarbeitet. Darüber hinaus konnten wir zeigen, dass CutA in Cyanobakterien nicht direkt an der Erkennung von Schwermetallionen beteiligt ist. Weiterhin konnten wir für SbtB als erstes Mitglied der PII-Superfamilie zeigen, dass neben den bekannten Effektoren ATP, ADP und AMP auch cAMP spezifisch gebunden wird. Jedoch blieben die sensorischen Eigenschaften von CutA unklar. Die Kristallstrukturen von CutA (Apo-Form) und SbtB (Apo-Form und im Komplex mit AMP und cAMP) konnte aufgeklärt werden. Dadurch konnte die Nukleotid-Bindetasche von SbtB in der lateralen Falte zweier Untereinheiten lokalisiert werden. Offenbar ist die trimere Grundstruktur der PII-ähnlichen Proteine SbtB und CutA ähnlich wie die der kanonischen PII-Proteine weit verbreitet. Dies zeigt eindeutig, dass die Proteine der PII-Superfamilie evolutionär aus einem gemeinsamen Vorfahren hervorgegangen sind.