In vivo-Studien zur ClpP-Maschinerie in Streptomyceten am Beispiel des ADEP-Produzenten Streptomyces hawaiiensis NRRL 15010 und des Modellorganismus Streptomyces lividans

Abstract

Streptomyces hawaiiensis NRRL 15010 ist der natürliche Produzentenstamm des Sekundärmetabolitkomplexes A54556, einem Extrakt mit bisher sechs strukturell aufgeklärten antibiotisch wirksamen Acyldepsipeptid-Derivaten (ADEPs). Diese Antibiotikaklasse zeigt eine vielversprechende Aktivität gegen verschiedenste Gram-positive Bakterien und weist einen vollkommen neuartigen Wirkmechanismus auf. Das ADEP-Target ist die proteolytische Kernkomponente ClpP der bakteriellen caseinolytischen Protease, einer ATP-abhängigen Serinprotease, die eine wichtige Rolle für die Proteinhomöostase und -qualitätskontrolle sowie die regulatorische Proteolyse spielt. Durch seine Bindung an ClpP verdrängt ADEP die mit ClpP assoziierten Clp-ATPasen von ihren Bindestellen und inhibiert dadurch sämtliche natürlichen Funktionen der Protease. Des Weiteren induziert die ADEP-Bindung eine Konformationsänderung der ClpP-Fassstruktur, welche die Eintrittspore zum katalytischen Zentrum erweitert, so dass essentielle Proteine hineingelangen und abgebaut werden, was einen letalen Effekt auf die bakterielle Zelle hat. Im Rahmen dieser Arbeit wurde das bisher unbekannte ADEP-Biosynthesegencluster in S. hawaiiensis identifiziert und analysiert. In der Nähe des Genclusters wurde zudem ein zusätzliches clpP-Homolog, clpPADEP, gefunden, welches als Resistenzfaktor gegen ADEP bestätigt werden konnte. Die Funktionalität von ClpPADEP sowie der durch dieses ClpP-Homolog vermittelte Resistenzmechanismus konnten nicht durch in vivo-Experimente im Produzentenstamm selbst untersucht werden, da es trotz einer Vielzahl angewandter Verfahren nicht gelang, den Stamm genetisch zu modifizieren. Allerdings konnte das Resistenzprinzip erfolgreich in den genetisch gut zugänglichen Modellorganismus S. lividans übertragen und dort untersucht werden. Bioassay- und Western Blot-Analysen ergaben deutliche Hinweise auf einen neuartigen, dualen Resistenzmechanimus, bei dem ClpPADEP sowohl die Detoxifizierung von durch ADEP überaktivierten ClpP-Komplexen, als auch die Bildung von funktionalen, ADEP-resistenten Komplexen bewirkt, und so das Überleben der bakteriellen Zelle sichert.