Development of capillary based separation techniques for the separation of proteins equilibrated using hexapeptide ligand libraries

DSpace Repository

Show simple item record

dc.contributor.advisor Huhn, Carolin (Prof. Dr.)
dc.contributor.author Meixner, Martin
dc.date.accessioned 2019-08-28T06:58:32Z
dc.date.available 2019-08-28T06:58:32Z
dc.date.issued 2020-06-30
dc.identifier.other 1702929221 de_DE
dc.identifier.uri http://hdl.handle.net/10900/92067
dc.identifier.uri http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:21-dspace-920674 de_DE
dc.identifier.uri http://dx.doi.org/10.15496/publikation-33448
dc.description.abstract Challenges in research areas such as chemistry, medicine, environmental toxicology and biology require the analysis of complex samples. Fast analysis of these samples using separation techniques with spectrometric or spectroscopic detection is common. Most often, chromatographic separation techniques such as gas and liquid chromatography coupled to mass spectrometry are chosen. These techniques, however, often reach their limits when highly charged analytes are investigated. Here, electromigrative separation techniques with their orthogonal separation mechanism are an attractive alternative. A very promising electrophoretic separation technique, which is primarily used during this work, is capillary electrophoresis (CE). One of the greatest challenges using this technique lies in the separation of biological samples, since analytes such as polyamines, peptides and proteins interact with and adsorb on the surface of “bare fused silica”-capillaries which impairs reproducibility. Without efficient suppression of these interactions, separation efficiency and run-to-run reproducibility suffer. A good way to suppress these detrimental interactions of analytes with the capillary surface is to modify the surface using of dynamic, statically adsorbed or covalently bound capillary coatings. In this work, I present approaches for the reproducible separation of polyamines, peptides and proteins: 1) In Chapter 2, the use of poly ethylene oxide as dynamic coating in SDS-CE enables the size-based separation of proteins up to a weight of 100 kDa. Advantages of this technique over classic gelbased SDS-PAGE are separation times of about 20 min and direct quantification via on-line UVdetection without the need of preliminary labeling or subsequent dyeing. Separation times were reduced to 5 min by short-end-injection and modification of the aperture for UV-detection. The presented separation system offers outstanding matrix tolerance: even complex samples such as serum were successfully separated without additional processing. Increased separation performance and efficiency were aspired by the addition of alkanols to the BGE, variation of temperature and the use of enrichment plugs in the capillary. Therein, especially the use of 2- propanol in the BGE proves fruitful regarding separation efficiency in the mass range up to 40 kDa. In Chapter 3 I will interpret my results with an extensive literature search to show, that the observed increase in separation efficiency is linked to a change of the separation mechanism from Reptation- to Ogston-sieving. 2) In Chapter 4, I proudly present, that I achieved CE-separation with MS-hyphenation not only for small polyamines and peptides, but also of large, non-digested proteins. This was possible using a single capillary coating only based on N-acryloylamido ethoxyethanol (AAEE). This highly polar and covalently bound capillary coating offers enjoyably high reproducibly and stability, the latter enabling operating times of 100 h, even when complex samples such as human serum and polyamines in fish eggs were analyzed. In Chapter 5 a novel and parallelized approach for the synthesis of this capillary coating is presented. SEM-measurements of the capillary surface between reaction steps forced me to postulate a novel reaction-mechanism for the formation of the coated surface. Additionally, I present, that pre-conditioning of capillaries with hypercritical water can result in higher reproducibility of capillary-to-capillary performance and reduced synthesis time. In Chapter 6 I will show that the presented separation techniques are excellent for the separation and detection of proteins equilibrated using hexapeptide ligand libraries (HLL). A novel approach for the consecutive equilibration of small sample volumes, which enables a deep insight into the proteome, is critically discussed. Challenges intrinsic to the solid phase extraction of proteins using HLLs are traced back to irreversible binding sites on HLLs. To tackle this issue, different elution and pre-equilibration protocols are designed and investigated. To re-establish binding conditions in consecutive equilibration, which is consecutive equilibration, different protocols for the processing of eluates from HLLs using 10 kDa cut-off filters are presented. Aspects that critically impair yields and recovery rates come to the fore and improved protocols are presented. A further project focused on CE-MS-based pI-value determination of a hardly soluble, cyclic and antibiotic peptide (Chapter 7). Detection of this peptide was not possible using AAEE-coated capillaries. This problem was overcome by using non-coated capillaries and BGEs containing small amounts of citric acid, which functions not only as buffer but also as a dynamic capillary coating. To confirm the determined pI-vaues, a novel and time-saving approach for the sequential injection of amino acid reference substances was developed. en
dc.description.abstract Fragestellungen in der Chemie aber auch in vielen anderen Disziplinen wie der Medizin, Umwelttoxikologie und Biologie, erfordern die Untersuchung von teilweise sehr komplexen Stoffgemischen. Eine schnelle Untersuchung von komplexen Proben ist mittels Trenntechniken, gefolgt von spektroskopischer oder spektrometrischer Detektion möglich. Zu den am weitesten verbreiteten Techniken gehören hierbei chromatographische Methoden wie die Gas- und Flüssigchromatographie, häufig gekoppelt mit Massenspektrometrie. Geraten diese chromatographischen Techniken an ihre Grenzen, beispielsweise bei hoch geladenen Stoffen, so bietet sich der Einsatz von elektromigrativen Trenntechniken an, da diese einen orthogonalen Trennmechanismus besitzen. Die Kapillarelektrophorese (engl.: capillary electrophoresis, CE), mit welcher sich diese Arbeit befasst, zählt zu den elektromigrativen Trenntechniken. Eine große Herausforderung dieser Technik besteht u.a. in der geringen Reproduzierbarkeit bei der Analytik von Biomolekülen, welche sich auf die Verwendung von „bare fused silica“-Kapillaren und deren Wechselwirkung mit den Analyten zurückführen lässt. Wird diese Wechselwirkung nicht effizient unterdrückt, so sinkt die Trenneffizienz innerhalb und die Wiederholbarkeit zwischen Trennungen. Durch die Verwendung von dynamischen, statisch adsorbierten oder kovalent gebundenen Kapillarbeschichtungen kann diese Wechselwirkung effizient unterdrückt werden. In dieser Arbeit werden mehrere Möglichkeiten zur reproduzierbaren Trennung von Polyaminen, Peptiden und Proteinen vorgestellt: 1) In Kapitel 2 wird durch die Verwendung von Polyethylenoxid als dynamische Beschichtung und Siebmatrix in der SDS-CE die größenbasierte Trennung von Proteinen bis zu einer Masse von 100 kDa erreicht. Ein Vorteil gegenüber klassischen gelbasierten Verfahren wie SDS-PAGE ist hierbei, dass Proben innerhalb von 20 min getrennt und durch on-column UV-Detektion quantifiziert werden können, ohne vor- oder nachträgliches Anfärben oder Derivatisieren. Durch eine selbst entworfene Modifikation der Trennapparatur und Injektion vom kurzen Ende der Kapillare konnte diese Trennzeit für ein schnelles Screening auf 5 Minuten reduziert werden. Das vorgestellte Trennsystem zeichnet sich durch eine hohe Matrixtoleranz aus; selbst Proben wie menschliches Serum können ohne Aufarbeitung injiziert werden. Eine Verbesserung der Auflösung und Trenneffizienz wurde durch die Verwendung von verschiedenen Alkoholen im Hintergrundelektrolyten, die Variation der Trenntemperatur und die Etablierung von Anreicherungszonen in der Kapillare angestrebt. Hierbei zeigte vor allem die Verwendung von 2- Propanol im Hintergrundelektrolyten eine erhöhte Trenneffizienz im Massenbereich bis ca. 40 kDa. In Kapitel 3 wird anhand der eigenen Ergebnisse und durch ausführliche Literaturarbeit gezeigt, dass diese Verbesserung der Auflösung durch eine Verschiebung des Trennmechanismus von Reptation- zu Ogstonsieben ermöglicht wird. 2) Durch die Verwendung einer sehr polaren kovalenten Kapillarbeschichtung, dem NAcryloylamido- ethoxyethanol (AAEE), lässt sich die kapillarelektrophoretische Trennung von kleinen Polyaminen und Peptiden, aber auch großen und unverdauten Proteinen, bei gleichzeitiger massenspektrometrischer Detektion erreichen. Dies wird in Kapitel 4 vorgestellt. Erfreulich hohe Einsatzzeiten von ca. 100 h und gute Wiederholbarkeiten werden sogar bei der Untersuchung von menschlichem Serum oder Polyaminen in Fischeiern beobachtet. In Kapitel 5 werden ein neuer und ABSTRACT (DEUTSCH) 4 parallelisierter Ansatz zur Kapillarsynthese sowie ein koexistenter und durch SEM-Aufnahmen postulierter Reaktionsmechanismus vorgestellt. Zusätzlich wird ein Ansatz zur Vorbehandlung der Kapillaren durch die Verwendung von überkritischem Wasser vorgeschlagen, welcher ersten Versuchen nach zu einer höheren Reproduzierbarkeit der Beschichtung und einer beschleunigten Synthese führen kann. In Kapitel 6 werden die vorgestellten Analysetechniken werden für die Bestimmung von Proteinen in mittels Hexapeptidligandenbibliotheken angereicherten Proben verwendet. Ein Ansatz zur mehrfachen Anreicherung, der einen tiefen Blick ins Proteom erlauben soll, wird kritisch bewertet. Herausforderungen in der Festphasenanreicherung werden auf irreversible Bindungsstellen zurückgeführt. In diesem Zusammenhang werden verschiedene Elutions- und PreÄquilibrierungsprotokolle untersucht. Für die erfolgreiche Wiederbeladung, welche einen tieferen Blick ins Proteom erlaubt, werden verschiedene Protokolle zur Aufarbeitung des Eluats mittels 10 kDa-Cut-off-Filtern vorgestellt. Kritische Aspekte, welche die Ausbeuten beeinträchtigen, werden beleuchtet und Lösungswege aufgezeigt. In Kapitel 7 wird die MS-basierte pI-Wertbestimmung eines schwerlöslichen zyklischen Peptidantibiotikums vorgestellt. Dieses konnte mit AAEE-beschichteten Kapillaren nicht erfasst werden. Diese Herausforderung konnte durch die Verwendung unbeschichteter Kapillaren und geringen Mengen Zitronensäure im Hintergrundelektrolyt, welche als dynamische Beschichtung fungiert, umgangen werden. Zur Absicherung der bestimmten pI-Werte mit Aminosäurestandards wurde ein neuer und zeitsparender Ansatz der sequentiellen Injektion entwickelt. de_DE
dc.language.iso en de_DE
dc.publisher Universität Tübingen de_DE
dc.rights ubt-podno de_DE
dc.rights.uri http://tobias-lib.uni-tuebingen.de/doku/lic_ohne_pod.php?la=de de_DE
dc.rights.uri http://tobias-lib.uni-tuebingen.de/doku/lic_ohne_pod.php?la=en en
dc.subject.classification Proteine , Analyse , Kapillarelektrophorese , Massenspektrometrie , Elektrophorese , Elektropherogramm de_DE
dc.subject.ddc 500 de_DE
dc.subject.ddc 540 de_DE
dc.subject.other proteominer en
dc.subject.other proteomics en
dc.subject.other Analytik de_DE
dc.subject.other capillary electrophoresis en
dc.subject.other analytical chemistry en
dc.subject.other mass spectrometry en
dc.subject.other capillary coating en
dc.subject.other size sieving electrophoresis en
dc.subject.other electrophoresis en
dc.subject.other proteins en
dc.subject.other protein en
dc.subject.other peptide en
dc.subject.other polyamines en
dc.subject.other blood serum en
dc.subject.other serum en
dc.subject.other protein equilibration en
dc.title Development of capillary based separation techniques for the separation of proteins equilibrated using hexapeptide ligand libraries en
dc.type Dissertation de_DE
dcterms.dateAccepted 2019-07-08
utue.publikation.fachbereich Chemie de_DE
utue.publikation.fakultaet 7 Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät de_DE

Dateien:

This item appears in the following Collection(s)

Show simple item record