Combined application of oncolytic vaccinia and measles vaccine viruses for the treatment of highly resistant human tumor cells

Abstract

Oncolytic viruses such as VACV and MeV are live, self-replicating biological anticancer agents, which have supplemented established therapies for quite a while (Bell, 2007). While sparing normal tissue, OVs destroy cancer cells by direct tumor cell lysis and the establishment of a host antitumor immune response (Kaufman et al, 2015). Nevertheless, primary resistance phenomenon to this novel approach hinders its widespread application. In 2010, Le Boeuf et al. published a promising attempt by demonstrating synergistic interaction between a VACV and a VSV strain (Le Boeuf et al, 2010). MeV and VACV proved to be safe, and moreover, convinced in some cases with outstanding oncolytic efficacy. On the basis of highly resistant tumor cells, we here investigated in vitro whether Le Boeuf´s findings were reproducible for VACV GLV-1h254 and vaccine-based measles construct MeV-GFP. In accordance with the researchers, we supposed that partial responsive-ness to IFN could have led to a reduced susceptibility of resistant tumor cells to oncolytic virotherapy (Le Boeuf et al, 2010). With GLV-1h254, however, we aimed to suppress the upcoming host antivirus immune reaction. Prior to double infection trials, it was necessary to determined suitable virus concentrations of both vectors for each cell line. We noticed that every cell line required different plating densities to reach confluence and, moreover, that cell density influenced survival of uninfected controls as well as virus spreading. After determination of threshold MOIs, we examined different orders of virus treatment and time points for secondary virus infection in double infection trials. SRB assay analysis ensured the superiority of the combinatorial treatment regime. Thus, sequential infections applying VACV prior to MeV-GFP achieved best results, while differences between time points of secondary virus infection had only minor impact. Admittedly, synergistic interaction was not observed and additive effects were limited. Naturally, our in vitro setting is unable to reflect the complex interactions between oncolytic agents and the host immune response. Thus, we recommend to pursue the here described findings in an immuno¬competent tumor model. This procedure albeit is hindered by the highly restricted host range of measles viruses, which only allows replicative infections in primates and humans. Sequential infections illustrated a phenomenon called “viral competition”. The majority of double-infected cells was either infected by one or the other, but not by both virus constructs simultaneously. The Keyence microscope was applied to examine this finding in detail. Although most sequentially infected cells exhibited sole infection, some of them glowed yellow, which indicated coinfection by VACV and MeV-GFP. Further trials applying SRB assay and western blot ensured that “viral competition” did not limit the oncolytic potential of the combinatorial treatment regime. However, further studies should focus on the underlying mechanism of the here described phenomenon and its occurrence with other oncolytic virus platforms.

Onkolytische Viren wie beispielsweise Vaccinia- und Masernimpfviren sind lebende, sich selbst replizierende biologische Krebsmedikamente, die schon seit einigen Jahren zusammen mit etablierten Therapien eingesetzt werden (Bell, 2007). Während normales Gewerbe geschont wird, zerstören onkolytische Viren Krebszellen zielgerichtet durch Tumorlyse sowie durch die Etablierung einer wirtseigenen, gerichteten Immunreaktion gegen die malignen Zellen (Kaufman et al, 2015). Primäre Resistenzphänomene hochresistenter Tumor¬zellen verhindern zurzeit einen flächendeckenden Einsatz dieser neuen Therapeutika. Im Jahr 2010 präsentierten Le Boeuf et al. einen vielversprechenden Ansatz (Le Boeuf et al, 2010). Durch den kombinierten Einsatz von Vaccinia und Vesicular stomatitis Viren konnte ein Synergismus erreicht, und dadurch primäre Resistenzen überwunden werden (Le Boeuf et al, 2010). Masern- und Vacciniaviren haben bewiesen, dass sie nicht nur sicher sind, sondern in einigen Fällen auch äußerst effizient Tumorzellen bekämpfen. Auf der Grundlage hochresistenter menschlicher Tumorzellen haben wir in dieser Arbeit untersucht, ob Le Boeufs Erkenntnisse auf das Vacciniavirus GLV-1h254 und das Masernimpfvirus MeV-GFP übertragbar sind. In Übereinstimmung mit den Forschern vermuteten wir, dass eine noch in Teilen bestehende Interferonantwort der Tumorzellen für das Auftreten primärer Virotherapie-Resistenzen verantwortlich sein könnte (Le Boeuf et al, 2010). Mit dem Einsatz des Vacciniavirus GLV-1h254 versuchten wir nun die gegen beide Viren gerichtete Immunreaktion zu unterbinden. Bevor mit den Doppelinfektionen begonnen werden konnte, war es nötig die für jede Tumorzelllinie passende Konzentration beider Viruskonstrukte zu bestimmen. Dabei fiel auf, dass jede Zelllinie unterschiedliche Auslegezellzahlen benötigte um Konfluenz zu erreichen, und mehr noch, dass dies sowohl das Überleben nicht infizierter Kontrollen als auch die Virusausbreitung beeinflusste. Nachdem die passenden Virusmengen bestimmt worden waren, untersuchten wir in Doppelinfektionsversuchen unterschiedliche Reihenfolgen und Zeitpunkte der Applikation der beiden Viruskonstrukte. Mit Hilfe des SRB Assays konnten wir die Überlegenheit eines kombinierten Verfahrens gegenüber Einzelinfektionen herausstellen. Doppelinfektionen mit Vaccinia als erstem Virus erzielten dabei die besten Ergebnisse, während der Zeitpunkt der Zweitinfektion die Resultate nur unwesentlich beeinflusste. Synergismus konnte dennoch nicht bestätigt werden, und auch die beobachteten additiven Effekte fielen nur gering aus. Naturgegeben ist unser in vitro-Setting nicht ausreichend um die komplexen Zusammenhänge zwischen onkolytischer Virotherapie und wirtseigener Immunreaktion zu bewerten. Wir empfehlen daher die hier erzielten Ergebnisse in einem immunkompetentem Tiermodel nachzuvollziehen. Zugegebenermaßen wird dieser Ansatz dadurch erschwert werden, dass Masernviren ausschließlich Primaten- und menschliche Zellen infizieren und sich in ihnen vermehren können. Während der Doppelinfektionsversuche beobachteten wir ein Phänomen, das wir „viralen Wettkampf“ tauften. Die Mehrzahl der doppelinfizierten Zellen war entweder vom ersten oder zweiten Viruskonstrukt infiziert, nicht jedoch von beiden gleichzeitig. Das Keyence Mikroskop half diese Beobachtung weiter zu verfolgen. Obwohl sich die meisten Zellen als einzelinfiziert zeigten, leuchteten einige wenige gelb auf und wurden somit als koinfiziert bewertet. Nachfolgende Analysen unter Verwendung des SRB Assays und Western Blot stellten sicher, dass der „virale Wettkampf“ nicht zu einer eingeschränkten Effektivität der Doppelinfektionen führte. Zukünftige Forschung sollte sich auf die zugrunde¬liegenden Mechanismen des hier beschriebenen Phänomens und ihr mögliches Auftreten bei weiteren onkolytischen Viren konzentrieren.