Dynamik der osteogenen Differenzierung von humanen mesenchymalen Stromazellen unter dem Einfluss von Laminin-5 in vitro

Abstract

Die aseptische Lockerung von Prothesen ist ein entscheidender Grund für die verkürzte Standzeit und Revisionsoperationen bei orthopädischen Implantaten. Durch die Optimierung der Integration des Implantats in den Knochen sollen diese Komplikationen verringert werden. Ein Ansatz hierzu ist die Beschichtung der Implantate mit Proteinen, die in der extrazellulären Matrix von Knochengewebe vorkommen und die ossäre Integration fördern. In dieser Versuchsreihe wurde der Einfluss von den Proteinen Laminin 5 und Laminin 1 im Vergleich zu Collagen I auf die osteogene Differenzierung von humanen mesenchymalen Stromazellen (hMSC) nach osteogener Induktion für 3, 7 und 28 Tage untersucht. Zudem sollte in dieser Versuchsreihe die erforderliche Stoffmenge dieser Proteine als untere Haftungsgrenze im Rahmen von Adhäsionsversuchen bestimmt werden. Humane mesenchymale Stromazellen wurden aus Knochenmark isoliert und unter GMP-konformen Bedingungen kultiviert. In der FACS-Analyse wurde das für hMSC typische Muster der Oberflächenantigene nachgewiesen. Der Nachweis ihres pluripotenten Potentials erfolgte mit Hilfe der von-KossaFärbung und Oil-Red-Färbung. Die hMSC wurden auf 6-Well-Platten gezüchtet, die mit Laminin 1, Laminin 5 und Collagen I beschichtet wurden oder keine Beschichtung hatten. Sie wurden 3, 7 und 28 Tage lang mit osteogenem Differenzierungsmedium im Vergleich zu Kontrollmedium kultiviert. Anschließend wurden die Platten mittels der vonKossa-Technik gefärbt und die Platten eingescannt. Hier zeigte sich, dass Laminin 5 zu einer dunkleren Färbung durch die verstärkte Einlagerung von Calciumphosphat in die extrazelluläre Matrix nach 7- und 28-tägiger osteogener Induktion führte. Laminin 1 hatte ebenfalls einen nachweisbaren, aber schwächeren positiven Effekt auf die Bildung einer osteogenen Matrix. Die hMSC wurden 3 und 7 Tage lang mit osteogenem Differenzierungs- und Kontrollmedium in Kulturflaschen gezüchtet, die mit Laminin 1, Laminin 5 und Collagen I beschichtet wurden oder keine Beschichtung hatten. Ihre DNA wurde isoliert und mittels RT-PCR wurde die Expression von 4 Markergenen der osteogenen Differenzierung (Osteopontin, Osteocalcin, Alkalische Phosphatase und Runx-2) gemessen. Aufgrund der niedrigen Fallzahlen von jeweils 2-4 MSC-Kulturen wurden keine Ergebnisse mit statistischer Signifikanz erbracht. Die initiale Haftung der MSC auf Laminin 1, Laminin 5 und Collagen I im niedrigen Stoffmengenbereich wurde mit Attachment Assays untersucht. MSCProben wurden 15 und 30 Minuten lang auf Stoffmengen von 1, 2 und 3 fmol der Proteine inkubiert und die initiale Haftung photographisch festgehalten. Es zeigte sich, dass Stoffmengen bis 3fmol nicht zur initialen Haftung der MSC ausreichten. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Laminin 5 und in geringerem Ausmaß auch Laminin 1 einen positiven Einfluss auf die Bildung von Calciumphosphatverbindungen durch hMSC bzw. Osteoblasten nach 7 und 28 Tagen der osteogenen Induktion haben. Zur Erreichen einer ausreichenden initialen Adhäsion der Zellen an beschichteten Materialien ist eine Stoffmenge von mehr als 3 fmol nötig. Als nächster experimenteller Schritt würde die Beschichtung von originalen Implantatoberflächen mit Laminin 5 erfolgen. Sollten sich bei diesen Experimenten in vitro ein positiver Effekt auf die Osteogenese wie in dieser Arbeit zeigen, würde ein Tierversuch folgen, bei dem Ausreißversuche mit Laminin 5 beschichteten Implantaten durchgeführt werden. Der letzte Schritt wäre die Implantation von entsprechend beschichteten Prothesen beim Menschen.