Inhaltszusammenfassung:
Die aseptische Lockerung von Prothesen ist ein entscheidender Grund für die
verkürzte Standzeit und Revisionsoperationen bei orthopädischen Implantaten.
Durch die Optimierung der Integration des Implantats in den Knochen sollen
diese Komplikationen verringert werden. Ein Ansatz hierzu ist die Beschichtung
der Implantate mit Proteinen, die in der extrazellulären Matrix von
Knochengewebe vorkommen und die ossäre Integration fördern. In dieser
Versuchsreihe wurde der Einfluss von den Proteinen Laminin 5 und Laminin 1
im Vergleich zu Collagen I auf die osteogene Differenzierung von humanen
mesenchymalen Stromazellen (hMSC) nach osteogener Induktion für 3, 7 und
28 Tage untersucht. Zudem sollte in dieser Versuchsreihe die erforderliche
Stoffmenge dieser Proteine als untere Haftungsgrenze im Rahmen von
Adhäsionsversuchen bestimmt werden.
Humane mesenchymale Stromazellen wurden aus Knochenmark isoliert und
unter GMP-konformen Bedingungen kultiviert. In der FACS-Analyse wurde das
für hMSC typische Muster der Oberflächenantigene nachgewiesen. Der
Nachweis ihres pluripotenten Potentials erfolgte mit Hilfe der von-KossaFärbung
und Oil-Red-Färbung.
Die hMSC wurden auf 6-Well-Platten gezüchtet, die mit Laminin 1, Laminin 5
und Collagen I beschichtet wurden oder keine Beschichtung hatten. Sie wurden
3, 7 und 28 Tage lang mit osteogenem Differenzierungsmedium im Vergleich
zu Kontrollmedium kultiviert. Anschließend wurden die Platten mittels der vonKossa-Technik
gefärbt und die Platten eingescannt. Hier zeigte sich, dass
Laminin 5 zu einer dunkleren Färbung durch die verstärkte Einlagerung von
Calciumphosphat in die extrazelluläre Matrix nach 7- und 28-tägiger osteogener
Induktion führte. Laminin 1 hatte ebenfalls einen nachweisbaren, aber
schwächeren positiven Effekt auf die Bildung einer osteogenen Matrix.
Die hMSC wurden 3 und 7 Tage lang mit osteogenem Differenzierungs- und
Kontrollmedium in Kulturflaschen gezüchtet, die mit Laminin 1, Laminin 5 und
Collagen I beschichtet wurden oder keine Beschichtung hatten. Ihre DNA wurde
isoliert und mittels RT-PCR wurde die Expression von 4 Markergenen der
osteogenen Differenzierung (Osteopontin, Osteocalcin, Alkalische
Phosphatase und Runx-2) gemessen. Aufgrund der niedrigen Fallzahlen von
jeweils 2-4 MSC-Kulturen wurden keine Ergebnisse mit statistischer Signifikanz
erbracht.
Die initiale Haftung der MSC auf Laminin 1, Laminin 5 und Collagen I im
niedrigen Stoffmengenbereich wurde mit Attachment Assays untersucht. MSCProben
wurden 15 und 30 Minuten lang auf Stoffmengen von 1, 2 und 3 fmol
der Proteine inkubiert und die initiale Haftung photographisch festgehalten. Es
zeigte sich, dass Stoffmengen bis 3fmol nicht zur initialen Haftung der MSC
ausreichten.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Laminin 5 und in geringerem Ausmaß
auch Laminin 1 einen positiven Einfluss auf die Bildung von
Calciumphosphatverbindungen durch hMSC bzw. Osteoblasten nach 7 und 28
Tagen der osteogenen Induktion haben. Zur Erreichen einer ausreichenden
initialen Adhäsion der Zellen an beschichteten Materialien ist eine Stoffmenge
von mehr als 3 fmol nötig.
Als nächster experimenteller Schritt würde die Beschichtung von originalen
Implantatoberflächen mit Laminin 5 erfolgen. Sollten sich bei diesen
Experimenten in vitro ein positiver Effekt auf die Osteogenese wie in dieser
Arbeit zeigen, würde ein Tierversuch folgen, bei dem Ausreißversuche mit
Laminin 5 beschichteten Implantaten durchgeführt werden. Der letzte Schritt
wäre die Implantation von entsprechend beschichteten Prothesen beim
Menschen.
