Nachweis von SRSF2-Mutationen bei der chronisch myelomonozytären Leukämie und verwandten myeloischen Neoplasien in Knochenmarksbiopsien

Abstract

Die CMML ist eine klonale und maligne Erkrankung der Hämotopoese. Sie zeigt sowohl Eigenschaften der myeloproliferativen als auch myelodysplastischen Erkrankungen zeigt und wird demnach in der WHO-Klassifikation den myelodysplastisch/myeloproliferativen Erkrankungen zugeordnet. Die Diagnose wird anhand verschiedener klinischer, laborchemischer, morphologischer und genetischer Kriterien gestellt, darunter beispielsweise eine persistierende Monozytose im peripheren Blutbild. Aufgrund vieler überlappender Eigenschaften ist eine Abgrenzung gängigen Differenzialdiagnosen wie MDS oder der PMF oft schwierig. In Studien wurde bei der CMML eine Mutationsfrequenz von 40-50% im SRSF2-Gen beobachtet. Das Ziel dieser Studie war die Etablierung einer Methode zur SRSF2-Mutationsanalyse an formalinfixierten, EDTA-entkalkten Knochenmarksbiopsien, die Korrelation der genetischen Ergebnisse mit klinischen und morphologischen Parametern sowie die Überprüfung, inwieweit eine SRSF2-Mutationsanalyse für die Diagnostik der CMML hilfreich sein kann.

36 Knochenmarksbiopsien von Patienten mit gesicherter CMML wurden auf die Mutation untersucht, dazu in Kontrollgruppen 20 Biopsien von MPN-Patienten, 22 von MDS-Patienten und 10 Biopsien mit normalen, bzw. reaktiv verändertem Knochenmark. Zur DNA-Extraktion wurde mit Xylol und Ethanol entparaffiniert, mit Protease verdaut und mit Phenol-Chloroform aufgereinigt. Ein Fragment von 145 bp, welches den Mutationshotspot im Kodon P95 in Exon 1 des SRSF2-Gens enthält, wurde mittels PCR amplifiziert und anschließend eine Mutationsanalyse durch bidirektionale Sanger-Sequenzierung durchgeführt. Zusätzlich wurde durch enzymatischen Verdau mit BsaJI und anschließender Agarose-Gelelektrophorese eine RFLP-Analyse als weitere Methode zur SRSF2-Mutationsanalyse etabliert. Ergänzend wurde bei allen Proben eine JAK2-Mutationsanalyse durch Allel-spezifische PCR mit anschließender Schmelzpunktanalyse durchgeführt.

Bei 16 der 36 CMML-Patienten (44%) wurde eine Mutation im SRSF2-Gen identifiziert[1]. In den Kontrollgruppen wurde eine Mutation bei vier MPN-Fällen (20%), bei einem MDS-Fall (4,5%) und bei keinem der normalen oder reaktiv veränderten Knochenmarksbiopsien beobachtet. Die RFLP-Analyse identifizierte alle Mutationen mit Ausnahme einer einzigen p.P95A-Mutation. Bei der CMML wurden keine Korrelationen des SRSF2-Mutationsstatus mit klinischen Parametern, der Knochenmarksmorphologie oder den Überlebensraten beobachtet. Das Vorhandensein von SRSF2-Mutationen war mit einem normalen Karyotyp assoziiert. Die JAK2-Mutation wurde bei fünf von 35 CMML-Fällen (17%) identifiziert. Bei drei der 36 Patienten war die CMML mit einer systemischen Mastozytose assoziiert (SM-AHNMD).

Die SRSF2-Mutationsanalyse konnte zuverlässig an formalinfixierten, EDTA entkalkten Knochenmarksbiopsien durchgeführt werden. Die in der vorliegenden Studie beobachtete Mutationsfrequenz von 44% bei der CMML lag im Bereich vorausgegangener Studienergebnisse. Somit stellt SRSF2 eines der am häufigsten bei der CMML mutierten Gene dar. Insbesondere in Fällen mit geringgradiger Dysplasie und normalem Karyotyp kann die SRFS2-Mutationsanalyse hilfreich für die Diagnosestellung bei der CMML sein. Die RFLP-Analyse konnte einen Großteil der Mutationen zuverlässig detektieren und kann somit als effiziente und kostengünstige Screening-Methode in der Diagnostik eingesetzt werden. Bei Fällen präfibrotischer PMF mit Monozytose konnte ebenfalls eine hohe SRSF2 Mutationsfrequenz beobachtet werden. Die pathogenetische Rolle sowie die prognostische Bedeutung von SRSF2-Mutationen bei myeloischen Neoplasien ist nicht abschließend geklärt und sollte Gegenstand zukünftiger Studien sein.