Modulation of the bacterial cell wall by N‐acetylmuramoyl‐L‐alanine amidases

Abstract

The bacterial cell wall is a highly dynamic structure that undergoes constant change in order to fulfill its various tasks, which range from physical protection against exterior stress and maintaining homoeostasis to immune evasion. A major component of the bacterial cell wall is the peptidoglycan network (PGN). Built up by a carbohydrate backbone of repeating units of N‐acetylglucosamine and N‐acetylmuramic acid linked to a peptide stem containing nonproteinogenic amino acids, PGN is a net‐like structure that harbors various proteins and anchors further components of the cell wall. Depending on the composition of the peptide stems and the type of cross‐linkage between the peptide stems, PGN can be a very dense network or a rather loose mesh. N‐acetylmuramoyl‐L‐alanine amidases cleave the amide bond between the carbohydrate backbone and the peptide stem and represent a class of PGN‐modulating enzymes that ensure its plasticity. My work focused on this class of enzymes in order to better understand the mechanisms that underlie PGN cleavage, and thus its plasticity, by using biochemical and cell biological tools in combination with X‐ray crystallography. The bifunctional major autolysin AtlA of Staphylococcus aureus contains a glucosaminidase and an amidase, which are post‐translationally processed and separated. Deletion of AtlA leads to cell clusters with irregular division patterns, indication a crucial role in cell division. I solved the atomic structure of the catalytic domain of the amidase, AmiA‐cat, in complex with its substrate component muramoyltetrapeptide. Close investigation of the molecular interactions between enzyme and substrate, along with the analyses of the apo‐structure and enzymatic activity assays, elucidated the likely reaction mechanism as well as substrate specificity. Since the intact substrate, including the scissile bond, is present in the complex structure, it moreover serves as a starting point for therapeutics against methicillin‐resistant Staphylococcus aureus. Further studies with AmiA‐cat in this regard involve a fragment‐based screening approach using X‐ray crystallography and the production and evaluation of therapeutic antibodies against AmiA‐cat as possible active agents. AmiC2 of the filamentous cyanobacterium Nostoc punctiforme fulfills a unique task in order to enable communication of neighboring cells within a filament. In contrast to cell‐splitting amidases, AmiC2 drills holes into the septal disk that separates neighboring cells, thus generating a nanopore array used for nutrient exchange and communication. My cooperation partner located AmiC2 in the maturating septum and I solved the structure of the catalytic domain of this enzyme, AmiC2‐cat. In comparison with the homologous enzyme AmiC E. coli, a regulatory α‐helix is missing, and AmiC2‐cat exhibits high activity, which can be abolished by mutation of a catalytic glutamate. Ongoing research is focused on the mechanism that governs activity and specificity of this unusual amidase. In particular, I study the separate and / or cooperative influence of the additional domains, AMIN‐A, AMIN‐B, and the proline‐rich linker of the AmiC2 holo‐enzyme on catalysis and specificity. Furthermore, in cooperation, I am working on elucidating the exact chemical composition of Nostoc PGN, perhaps even differences between nascent, septal, and mature PGN. The results will be essential to generate complex structures, and elucidating potential PGN differences will provide insights into specificity.

Die Bakterienzellwand ist eine hochdynamische Struktur, die einem ständigen Wandel unterliegt, um ihre verschiedenen Aufgaben zu erfüllen. Diese reichen von physischem Schutz gegen äußere Belastungen über die Aufrechterhaltung der Zellhomöostase bis zur Immunevasion. Ein Hauptbestandteil der bakteriellen Zellwand ist das Peptidoglycan (PGN). Es ist aus einem Kohlenhydratgerüst mit abwechselnden Einheiten von N‐Acetylglucosamin und N‐Acetylmuraminsäure sowie einem Peptidstamm, der auch nicht‐proteinogene Aminosäuren beinhaltet, aufgebaut. PGN ist eine netzartige Struktur, die außerdem verschiedene Proteine und weitere Komponenten der Zellwand verankert. Je nach Zusammensetzung des Peptidstammes selbst und der Art der Vernetzung zwischen den Peptidstämmen kann das PGN ein sehr dichtes Netz oder ein eher lockeres Geflecht sein. N‐Acetylmuramoyl‐L‐Alanin‐Amidasen spalten die Amidbindung zwischen dem Kohlenhydratgerüst und dem Peptidstamm und stellen eine Klasse von PGN‐modulierenden Enzymen dar, die seine Plastizität sicherstellen. Die vorliegende Arbeit konzentriert sich auf diese Enzymklasse und soll zum Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen jener enzymatischen Spaltung beitragen, die für die Plastizität von PGN verantwortlich ist. Dieser Fragestellung wurde mit Hilfe biochemischer und zellbiologischer Methoden sowie der Röntgenstrukturanalyse nachgegangen. Das bi‐funktionelle Major Autolysin AtlA von Staphylococcus aureus besteht aus einer Glucosaminidase und einer Amidase, welche posttranslational voneinander getrennt werden. Das gezielte Abschalten (Knockout, Nullmutante) von AtlA führt zu Zellclustern mit unregelmäßigem Teilungsmuster, was eine entscheidende Rolle bei der Zellteilung nahelegt. Ich habe die atomare Struktur der katalytischen Domäne der Amidase, AmiA‐cat, im Komplex mit ihrem Substratbestandteil Muramoyltetrapeptid gelöst. Sowohl die genaue Untersuchung der molekularen Wechselwirkungen zwischen Enzym und Substrat sowie die Analyse der apo‐ Struktur als auch enzymatische Aktivitätstests haben Anhaltspunkte für den wahrscheinlichen Reaktionsmechanismus sowie die Substratspezifität des Enzyms geliefert. Da das intakte Substrat einschließlich der zu spaltenden Bindung in der Komplexstruktur vorhanden ist, dient sie ferner als ein guter Startpunkt für Therapeutika gegen den Methicillin‐resistenten Staphylococcus aureus. Weitere Studien mit AmiA‐cat in diese Richtung beinhalten neben einem fragmentbasierten Screeningansatz unter Zuhilfenahme von Röntgenkristallographie auch die Produktion und Tests von therapeutischen Antikörpern gegen AmiA‐cat als mögliche Wirkstoffe. AmiC2 des filamentösen Cyanobakteriums Nostoc punctiforme führt eine einzigartige Reaktion aus, um die Kommunikation von benachbarten Zellen innerhalb eines Filaments zu ermöglichen. Im Gegensatz zu zellspaltenden Amidasen bohrt AmiC2 Löcher in das Septum, welches Nachbarzellen voneinander trennt. Dadurch entsteht ein Nanopore Array, das für Nährstoffaustausch und Kommunikation verwendet wird. Meine Kooperationspartner haben AmiC2 im ausreifenden Septum lokalisiert, und ich habe die Struktur der katalytischen Domäne dieses Enzyms gelöst (AmiC2‐cat). Interessanterweise fehlt eine regulatorische α‐Helix, wie man sie in dem homologen Enzym AmiC E. coli findet. AmiC2‐cat ist katalytisch sehr aktiv, was durch die Mutation eines katalytischen Glutamats aber aufgehoben werden kann. Weitergehende Forschung zielt auf die Aufklärung des Mechanismus ab, der die Aktivität und Spezifität dieser ungewöhnlichen Amidase regelt. Insbesondere wird momentan der getrennte und / oder kooperative Einfluss der zusätzlichen Domänen des AmiC2‐Holoenzyms ‐ AMIN‐A, AMIN‐B sowie Prolin‐reicher Linker ‐ auf die Katalyse und Spezifität von AmiC2‐cat erforscht. Außerdem wird die genaue chemische Zusammensetzung des PGN von Nostoc untersucht, um den physiologischen Liganden von AmiC2 für eine Komplexstruktur zu identifizieren. Weiterhin könnten eventuelle Unterschiede zwischen jungem, septalem und reifem PGN eine Rolle bei der enzymatischen Spezifität spielen.