Arabidopsis 14-3-3 Epsilon-Gruppe: Ihre Bedeutung für Wachstums- und Differenzierungsprozesse

Abstract

14-3-3 Proteine bilden eine Familie von hoch konservierten regulatorischen Molekülen, die in allen Eukaryoten exprimiert werden. Sie sind Phosphoserin/threonin Sensoren und modifizieren die Aktivität ihrer Zielproteine. In Arabidopsis thaliana werden 13 hoch homologe Isoformen exprimiert, die in zwei phylogenetische Gruppen unterteilt werden, die Epsilon und die Non-Epsilon Gruppe. In dieser Arbeit sollte die Funktion und die genaue Bedeutung der 14-3-3 Epsilon Gruppe im Hinblick auf Wachstums-und Differenzierungsprozesse in Arabidopsis thaliana analysiert werden.Diesbezüglich wurde eine RNAi-Mutante untersucht, die eine ethanolabhängige Reduktion der Expression der drei Isoformen epsilon, mu und omicron führt. Diese emo Mutante (drei unabhängige emo-Linien: emo-1, emo-2 und emo-3; emo-1 diente als Grundlage für alle weiteren Versuche und Kreuzungen) zeigt als Folge einer Ethanolinduktion einen pleiotropen Phänotyp, der sich im Licht durch epinastische Kotyledonen, ein verlängertes Hypokotyl und ein verkürztes Wurzelwachstum ohne Lateralwurzeln und im Dunkeln durch ein verkürztes Hypokotyl ohne Plumulahaken auszeichnet. Auf der Grundlage physiologischer Experimente und Untersuchungen und unter Einsatz von Auxin-responsiven Reportern (DR5::GUS, DR5rev::GFP) konnte eine Inhibierung des polaren Auxintransports als ursächlich für den emo Phänotyp aufgezeigt werden. Die Reduktion der Expression von emo führt demnach zu einer Akkumulation von Auxin in den oberirdischen Pflanzenteilen während die Wurzel an Auxin verarmt. 14-3-3 Proteine sind als Aktivatoren des plasmamembranständigen H+-ATPase bekannt, deren Aktivität entscheidend für den Import von Auxin in die Zelle und damit sekundär für den gerichteten Export ist. Pharmakologische und insbesondere genetische Ansätze, die eine induzierbare Expression einer konstititiv aktiven H+-ATPase ermöglichen, machte deutlich, dass eine Inhibierung des Enzyms als Folge der reduzierten 14-3-3 Expression nicht die Ursache des emo-Phänotyps ist. Ebenso konnte mittels rBiFC und Y2H Experimente keine direkte Interaktion zwischen 14-3-3 und PIN Proteinen, bekannte Auxin Effluxcarrier, nachgewiesen werden. Immunologische Untersuchungen von PIN::PIN-GFP Linien zeigten jedoch, dass der PIN Gehalt in Mikrosomen aus ethanolinduzierten emo-Keimlingen signifikant gegenüber den Kontrollen gesteigert ist. Da dies nicht auf eine veränderte Transkription zurückzuführen war, wurden nachfolgend vesikuläre Transportprozesse im Detail analysiert. Die in vivo Visualisierung von PIN2 auf der zellulären Ebene in Kombination mit Vesikeltransportinhibitoren wir Brefeldin A und Wortmannin oder endosomale Markerproteine zeigte eindeutig, dass die reduzierte Expression von 14-3-3 Epsilon Mitgliedern eine Hemmung multipler endocytischer Transportwege zur Folge hat. So lassen sich Defekte im Transportweg vom TGN zur Vakuole sowie zur Plasmamembran nachweisen. Demzufolge sind 14-3-3 Epsilon Mitglieder für den endocytischen Vesikeltransport in pflanzlichen Zellen somit für Wachstums- und Differenzierungsprozesse von entscheidender Bedeutung.