Regulation of Ca2+ Signaling and Ca2+-Sensitive Functions of Mouse Dendritic Cells by AMP-Activated Protein Kinase and Klotho Protein

Abstract

Dendritic cells (DCs) are antigen-presenting cells participating in the regulation of innate and adaptive immunity. The functions of DCs are governed by Ca2+ signaling. Ca2+-sensitive functions include DC activation, maturation and migration, as well as formation of the immunological synapse. Upon ligation of their chemokine receptors, such as CXCR4, DCs respond with a fast increase of intracellular Ca2+ concentrations ([Ca2+]i), which involves release of Ca2+ from the stores followed by Ca2+ entry through the store-operated Ca2+ (SOC) channels. While the activity of SOC channels is crucial for DC migration, the SOC-induced increase of [Ca2+]i is tightly controlled and rapidly terminated, since Ca2+ overload impairs DC migration. In DCs, increase of [Ca2+]i is efficiently blunted and terminated by Ca2+ extrusion, which is accomplished by K+-independent (NCX) and K+-dependent (NCKX) Na+/Ca2+ exchangers. Very little is known about how Ca2+ signaling and Ca2+-dependent functions are regulated. The present study pursued two aims. The first aim was to investigate the potential role of AMPK in the regulation of cytosolic Ca2+ concentration and Ca2+-dependent functions of mouse DCs. The second aim was to study the effects of Klotho in the regulation of the components of Ca2+ signaling and Ca2+-dependent functions in DCs. One of the signaling molecules activated by Ca2+ is the energy-sensing AMP-activated protein kinase (AMPK), which is known to suppress proinflammatory responses of DCs and macrophages. To explore whether AMPK participates in the regulation of Ca2+ entry, Ca2+ extrusion and, thereby Ca2+-dependent functions in DCs, bone marrow-derived DCs were obtained from AMPKalpha-deficient mice (ampk-/-) and from respective wild type littermates (ampk+/+). As measured in transwell chambers, the efficiency of ampk-/- DCs to migrate in response to the CXCL12 (75 ng/ml) chemokine was strongly enhanced. Similarly, CXCL12 (300 ng/ml)-induced increase of [Ca2+]i was much higher in ampk-/- DCs than in ampk+/+ DCs, as measured by Fura-2 fluorescence. Accordingly, when SOC channels were activated by inhibition of the endosomal Ca2+ ATPase with thapsigargin, SOC entry was significantly increased in ampk-/- DCs. Orai1 protein abundance was enhanced in ampk-/- DCs. Moreover, upon removal of external Na+, activities of both NCX and NCKX were significantly enhanced in ampk-/- DCs as compared to ampk+/+ DCs. Similarly, in patch clamp experiments, the NCX and NCKX currents were both significantly increased in ampk-/- DCs. In conclusion, AMPK strongly suppresses DC migration, presumably through inhibition of both, SOC entry and Na+/Ca2+ exchangers in DCs. NCKX exchangers are stimulated by immunosuppressive 1,25(OH)2D3. Formation of 1,25(OH)2D3 is inhibited by the anti-aging protein Klotho. Thus, 1,25(OH)2D3 plasma levels are excessive in Klotho-deficient mice (klothohm). The present study explored whether Klotho-deficiency modifies [Ca2+]i regulation in DCs. DCs were isolated from bone marrow of klothohm mice and corresponding wild type mice (klotho+/+) and cultured for 7 to 9 days with GM-CSF. According to MHC II and CD86 expression, differentiation and lipopolysaccharide (LPS)-induced maturation was similar in klothohm and klotho+/+ DCs. However, NCKX activity was significantly enhanced in klothohm DCs. The [Ca2+]i increase upon acute application of LPS (1 µg/ml) was significantly lower in klothohm DCs than in klotho+/+ DCs, a difference reversed by NCKX-blocker 3’,4’-dichlorobenzamyl (DBZ, 10 µM). CCL21-dependent migration was significantly reduced in klothohm DCs compared to klotho+/+ DCs. NCKX activity could be enhanced by pretreating klotho+/+ DC precursors with 1,25(OH)2D3 for the first 2 days after isolation from bone marrow. Feeding klothohm mice a vitamin D deficient diet decreased NCKX activity, augmented LPS-induced increase of [Ca2+]i, and enhanced migration of klothohm DCs, thus dissipating the differences between klothohm DCs and klotho+/+ DCs. Impaired migration of klothohm DCs could be also rescued by DBZ (10 µM). In conclusion, Klotho deficiency up-regulates Na+/Ca2+ exchange activity and thus blunts the increase of [Ca2+]i following LPS exposure and CCL21-mediated migration. These effects are in large part due to excessive 1,25(OH)2D3 formation.

Dendritische Zellen (DCs) sind Antigen-präsentierende Zellen, die an der Regulation der angeborenen und adaptiven Immunantwort teilnehmen. Die Funktionalität von DCs wird vom "Ca2+-Signalling" bestimmt. Ca2+- sensitive Funktionen umfassen die Aktivierung, Reifung und Migration von DCs sowie die Bildung der immunologischen Synapse. Auf die Bindung eines Liganden an die membranständigen Chemokin-Rezeptoren, beispielsweise CXCR4, antworten DCs mit einem schnellen Anstieg der zytosolischen Ca2+-Konzentration ([Ca2+]i), der durch den Ausstrom von Ca2+ aus den Speichern und den Einstrom durch die “store-operated Ca2+ (SOC)”-Kanäle bewirkt wird. Die Aktivität der SOC-Kanäle ist wichtig für die Migration der DCs. Gleichzeitig jedoch muss der SOC-induzierte Anstieg von [Ca2+]i eng kontrolliert und zügig beendet werden, da ein Ca2+-Überfluss die Migration beeinträchtigt. In DCs wird die Erhöhung von [Ca2+]i durch die Ausschleusung von Ca2+ abgeschwächt und schließlich gestoppt. Diese erfolgt über K+-unabhängige (NCX) und K+-abhängige (NCKX) Na+/Ca2+-Austauscher. Sehr wenig ist darüber bekannt, wie das Ca2+-Signal und Ca2+-abhängige Funktionen reguliert werden. Die vorliegende Studie verfolgt zwei Ziele. Das erste Ziel war, die mögliche Rolle von AMPK bei der Regulation cytosolischer Ca2+-Konzentrationen und Ca2+-abhängiger Funktionen in murinen DCs aufzuzeigen. Das zweite Ziel war, mögliche Effekte von Klotho auf die Regulation von Ca2+-Signalkomponenten und Ca2+-abhängigen Funktionen in DCs zu untersuchen.

Eines der durch Ca2+ aktivierten Signalmoleküle ist die Energie-sensitive AMP-aktivierte Proteinkinase (AMPK), die für ihre Unterdrückung proinflammatorischer Antworten von DCs und Makrophagen bekannt ist. Um herauszufinden, ob AMPK an der Regulation des Ca2+-Eintritts oder Ca2+-Ausstoßes und somit Ca2+-abhängiger Funktionen in DCs teilnimmt, wurden DCs aus dem Knochenmark von AMPKalpha-defizienten Mäusen (ampk-/-) und ihren Wildtyp-Wurfgeschwistern (ampk+/+) angezogen. In ampk-/- DCs war die durch das Chemokin CXCL12 (75 ng/ml) vermittelte Migrationseffizienz (gemessen in „Transwell“-Kammern) deutlich gesteigert. Gleichermaßen war der durch CXCL12 (300 ng/ml) ausgelöste [Ca2+]i –Anstieg (gemessen mittels Fura-2 Fluoreszenz) viel stärker ausgeprägt in ampk-/- DCs als in ampk+/+ DCs. Darüber hinaus war der SOC-Einstrom in ampk-/- DCs signifikant erhöht, wenn die SOC-Kanäle durch die Inhibierung der endosomalen Ca2+-ATPase mit Thapsigargin aktiviert wurden. Die Orai1-Proteinmenge war größer in ampk-/- DCs. Darüberhinaus war die Aktivität von NCX und NCKX nach Entfernung von externem Na+ signifikant erhöht in ampk-/- DCs verglichen mit ampk+/+ DCs. Gleichermaßen waren die Ströme in “patch-clamp” Experimenten von NCX und NCKX signifikant erhöht in ampk-/- DCs. Folglich unterdrückt AMPK die Migration von DCs, vermutlich durch eine Hemmung des SOC-Einstroms und der Na+/Ca2+-Austauscher in DCs.

NCKX Austauscher werden von dem immunsuppressiven 1,25(OH)2D3 stimuliert. Die Bildung von 1,25(OH)2D3 wird gehemmt durch das Anti-Alterungsprotein Klotho. Daher sind 1,25(OH)2D3 Plasmaspiegel in Klotho-defizienten Mäusen (klothohm) stark überhöht. Diese Studie hat untersucht, ob Klotho-Mangel die [Ca2+]i-Regulation in DCs beeinflußt. DCs wurden aus dem Knochenmark von klothohm- und entsprechenden Wildtyp-Mäusen (klotho+/+) isoliert und für 7-9 Tage mit GM-CSF kultiviert. In Bezug auf MHC II- und CD86-Expression war die Differenzierung und die Lipopolysaccharid (LPS)-induzierte Reifung ähnlich in klothohm und klotho+/+ DCs. Allerdings war die NCKX-Aktivität in klothohm DCs signifikant erhöht. Der [Ca2+]i -Anstieg nach einer akuten Applikation von LPS (1 µg/ml) war signifikant schwächer ausgeprägt in klothohm DCs als in klotho+/+ DCs, ein Unterschied, der durch den NCKX-Blocker 3’,4’-dichlorobenzamyl (DBZ, 10 µM) aufgehoben wurde. Die CCL21-abhängige Migration war signifikant geringer in klothohm DCs als in klotho+/+ DCs. Die NCKX-Aktivität konnte verstärkt werden durch Vorbehandlung der klotho+/+ DC-Vorläufer mit 1,25(OH)2D3 für die ersten zwei Tage nach der Isolation aus dem Knochenmark. Das Füttern der klothohm-Mäuse mit einer Vitamin D-armen Diät erniedrigte die NCKX-Aktivität, vergrößerte den LPS-induzierten Anstieg von [Ca2+]i und förderte die Migration von klothohm DCs und hob somit die Unterschiede zwischen klothohm und klotho+/+ DCs auf. Die beeinträchtigte Migration von klothohm DCs konnte auch durch DBZ (10 µM) wiederhergestellt. Schlussfolgernd ist festzustellen, dass der Klotho-Mangel die Na+/Ca2+-Austauschaktivität heraufreguliert und so den [Ca2+]i -Anstieg nach LPS-Stimulation und die CCL21-abhängige Migration abschwächt. Diese Effekte liegen zum größten Teil begründet in der übermäßigen Bildung von 1,25(OH)2D3.