Characterization of Apoptosis and DNA Damage Response in Human Induced Pluripotent Stem Cells

Abstract

Unlike any other discovery in life sciences throughout the past years, human induced pluripotent stem (iPS) cells have raised the hope for personalized medical therapies. IPS cells represent embryonic stem (ES)-like cells, are immortal and can, in principle, infinitely give rise to all somatic cells and their precursors. Since they are generated from patient-derived cells (e.g. fibroblasts), they enable isogenic replacement of defective tissues or cells such as cardiomyocytes after cardiac infarction or dopaminergic neurons in Parkinson's disease. In addition, during iPS cell generation no human embryos are destroyed, thereby circumventing several ethical issues that accompany scientific or medical applications employing ES cells. However, iPS cells do not exhibit all features of ES cells. At least in part, iPS cells keep the epigenetic "memory" of their cells of origin. Likewise, genomic instability, chromosomal aberrations and mutations can hardly be removed during or after reprogramming. This is of prime importance as pluripotent cells generally exhibit increased tumorigenic potential compared to terminally differentiated cells. A detailed understanding of survival and apoptosis pathways is, hence, essential for the development of safe stem cell therapies.

In the first part, this thesis elucidates apoptotic responses in iPS cells, fibroblasts and a control cell line (Jurkat) upon extrinsic, intrinsic and ER stress stimulation. It is demonstrated that iPS cells prove hypersensitive to DNA double-strand breaks(DSB)-inducing treatment, but resist extrinsic death ligands, while fibroblasts show a reversed pattern of susceptibility. In order to link the extent of cellular DNA damage to the induction of apoptosis, an accurate and sequence-specific real-time PCR-based method for DNA damage quantification was developed. The characterization and specification of the method and different applications are subject of the second section of this work. It is shown that, although being highly sensitive to DSBs in terms of apoptosis, iPS cells acquire lower DNA lesion rates than fibroblasts and Jurkat cells, indicating elevated protection mechanisms in iPS cells. The last part of this thesis discusses the examination of such DNA damage prevention mechanisms. It is demonstrated that the level of the most important cellular small molecule antioxidant, glutathione (GSH), is elevated in iPS cells compared to fibroblasts. In addition, fibroblasts and Jurkat cells exhibited significantly increased DNA damage upon genotoxic treatment after GSH depletion. However, in iPS cells, GSH depletion had no effect on DNA damage frequency. Finally, increased expression of various genes coding for proteins or enzymes involved in antioxidative defense was found in iPS cells.

The current work provides new insights into the apoptotic response, the relation between DNA damage and apoptosis and cellular DNA damage prevention mechanisms in human pluripotent cells, which might prove useful for a more detailed understanding of physiological properties of this promising new cell type.

Wie kaum eine andere wissenschaftliche Entdeckung haben humane induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen) die Hoffnung auf personalisierte Therapien belebt. Sie sind embryonalen Stammzellen (ES-Zellen) ähnlich, immortal und können alle somatischen Zelltypen und deren Vorläufer in prinzipiell unbegrenzter Anzahl hervorbringen. Da sie aus Fibroblasten oder anderen Zelltypen patienten-spezifisch erzeugt werden können, eröffnen sie die Möglichkeit, mit körpereigenen Ersatzgeweben ohne Abstoßungsreaktion defekte oder abgestorbene Zellen zu ersetzen, z.B. Herzmuskelzellen nach einem Herzinfarkt oder dopaminerge Neuronen bei Parkinson-Patienten. Zugleich werden zu ihrer Herstellung keine menschlichen Embryonen zerstört, weswegen die ethische Problematik, welche bei Verwendung von ES-Zellen besteht, weitgehend entfällt. Dennoch sind iPS-Zellen und ES-Zellen nicht identisch. So behalten iPS-Zellen teilweise das epigenetische "Gedächtnis" ihrer Herkunftszellen bei. Auch mögliche genomische Instabilität, chromosomale Aberrationen und Mutationen des Erbguts der Ausgangszellen können nur teilweise wieder rückgängig gemacht werden. Dies ist von besonderer Brisanz, da pluripotente Zellen generell ein erhöhtes Potential zur Erzeugung von Tumoren besitzen. Das Verständnis der Regulation von Überlebens- und Apoptose-Signalen in iPS-Zellen ist daher von zentraler Bedeutung für die zukünftige Entwicklung sicherer Stammzelltherapien.

Die vorliegende Dissertation behandelt im ersten Teil die umfassende vergleichende Charakterisierung von zellulären Reaktionen auf extrinsische, intrinsische und ER-Stress-vermittelte Apoptose-Signale in humanen iPS-Zellen, Fibroblasten und einer Kontroll-Zelllinie (Jurkat). Es wird gezeigt, dass iPS-Zellen hochsensitiv auf DNA-Doppelstrangbruch(DSB)-induzierende Behandlung reagieren, jedoch Signalen durch extrinsische Todesliganden widerstehen. In Fibroblasten wird das umgekehrte Sensitivitätsprofil demonstriert. Um den Zusammenhang zwischen dem Ausmaß des induzierten DNA-Schadens und dem Eintritt von Apoptose zu untersuchen, wurde eine akkurate und sequenzspezifische Methode zur Real-time PCR-basierten DNA-Schadens-quantifizierung entwickelt. Diese Methodenentwicklung und deren Anwendung auf DNA-Schadensbestimmung in Fibroblasten, iPS- und Jurkat-Zellen werden im zweiten Abschnitt erläutert. Es wird gezeigt, dass iPS-Zellen trotz hoher Empfindlichkeit gegenüber DSBs geringere Schadensraten als Fibroblasten und Jurkat-Zellen aufweisen, was auf erhöhte zelluläre Schutzmechanismen in iPS-Zellen schließen lässt. Der letzte Abschnitt behandelt die Untersuchung dieser Schutzmechanismen. Es wird gezeigt, dass das wichtigste zelluläre Molekül zur Verteidigung gegen oxidative Schäden, Glutathion, in iPS-Zellen in erhöhten Spiegeln vorhanden ist. Die Depletion von Glutathion kann die DNA-Schädigung in Fibroblasten und Jurkat-Zellen deutlich verstärken, nicht jedoch in iPS-Zellen. Weiterhin werden zahlreiche Gene antioxidativer Proteine und Enzyme identifiziert, deren Expression in humanen iPS-Zellen gegenüber Fibroblasten erhöht ist.

Die vorliegende Arbeit liefert Einblicke in die Zelltod-Regulation, den Zusammenhang von DNA-Schaden und Apoptose sowie die DNA-Schadensprävention in humanen iPS-Zellen. Sie leistet daher einen Beitrag zum besseren Verständnis der Eigenschaften dieses neuen, vielversprechenden Zelltyps.