Structural Analyses of the T1L Reovirus Attachment Protein sigma 1 and the Phytophthora sojae Transglutaminase GP42

Abstract

This thesis structurally analyzes the attachment protein sigma1 of Type 1 reovirus and the GP42 transglutaminase (TGase) from the plant pathogen Phytophthora sojae. Reoviruses serve as model systems to study virus-host interactions and are currently tested in clinical trials as oncolytic agents. The reovirus outer capsid protein sigma 1 mediates initial attachment of the virus to its host cell and is therefore a major determinant of target cell selection and viral tropism. The specific interaction between the trimeric sigma a1 protein and carbohydrates on the surface of host cells is thought to cause these serotype-dependent differences in tropism and pathogenesis. By glycan array analyses with purified sigma 1 protein, this study identified the carbohydrate receptor of Type 1 Lang (T1L) reovirus, the GM2 glycan. The interaction between the GM2 tetrasaccharide and T1L sigma 1 in solution was confirmed by STD NMR spectroscopy. Subsequent determination of the crystal structure of the C-terminal part of T1L sigma 1 in complex with the GM2 glycan allowed us to understand the specific recognition of the GM2 glycan by T1L sigma 1 at an atomic level and to define residues required for functional carbohydrate engagement. The GM2 glycan serves as a serotype-specific receptor for T1L reovirus. Thus, the identification of the glycan receptor of Type 1 reovirus and the structural analyses of the sigma 1-carbohydrate complex help to explain differences in tropism between reovirus serotypes and expand knowledge of virus-host interaction and viral attachment mechanisms. In addition, the N-terminal tail domain of sigma 1 was structurally investigated. The sigma 1 tail carries a heptad repeat pattern characteristic for coiled coil formation. Two different segments of the tail domain were crystallized, and both structures were determined at high resolution. The structures confirmed that a large portion of the T1L sigma 1 tail folds into an alpha-helical coiled coil and revealed interactions that stabilize the trimeric coiled coils. The structures furthermore help to establish reovirus sigma 1 as a platform into which helical elements from other proteins can be inserted and presented for antibody recognition. Such chimeric reoviruses could be used as vaccines to trigger the production of antibodies against conserved viral epitopes, such as the A helix of the influenza virus hemagglutinin. In the second project, the crystal structure of the TGase GP42 from the parasitic plant pathogen, Phytophthora sojae, was solved. Phytophthora species are oomycetes that cause huge economic losses by infecting a variety of plants, including potato, cacao, oak, and soybean. Interestingly, all Phytophthora species tested so far possess an enzyme homologous to GP42, including a conserved peptide of 13 amino acids. This peptide, Pep-13, is recognized by the plant immune system and elicits an immune response in host and non-host plants. The GP42 crystal structure demonstrates that Pep-13 forms a beta-strand on the surface of the TGase, where most residues are well accessible for components of the plant immune system. Furthermore, the GP42 crystal structure suggests that the active site of the enzyme comprises a catalytic triad composed of Cys290, His291, and Asp328. Although there is no sequence homology between GP42 and human or bacterial TGases, GP42 shares a central core fold with papain-like cysteine proteases. Sequence comparisons between GP42 and homologs from other oomycetes showed that conserved residues cluster around the active site of the enzyme. Thus, the crystal structure of GP42 serves as a model for TGases from related oomycetes. Additionally, a search for sequence homologs of GP42 outside the oomycete taxonomic group identified GP42-like proteins in marine vibrio bacteria, suggesting an evolutionary relationship between these organisms and Phytophthora.

Diese Dissertation umfasst die strukturelle Charakterisierung des Kapsidproteins sigma 1 von Typ 1 Reovirus und der Transglutaminase (TGase) GP42 des Pflanzenpathogens Phytophthora sojae. Reoviren dienen als Modellsystem zur Erforschung der Interaktion zwischen Virus und Wirt. Darüber hinaus werden sie in klinischen Studien zur Krebstherapie eingesetzt, da sie bestimmte Tumorzellen gezielt lysieren können. Das Reoviruskapsidprotein sigma 1 vermittelt das initiale Andocken des Virus an die Wirtszelle und beeinflusst dadurch, welche Zellen infiziert werden. Ausschlaggebend, ob eine Zelle tatsächlich infiziert wird, sind möglicherweise die spezifischen Wechselwirkungen zwischen sigma 1 und Zuckerstrukturen auf der Zelloberfläche. Im Rahmen dieser Dissertation wurde die Zuckerverbindung identifiziert, an die Reovirus Typ 1 Lang (T1L) spezifisch andockt, um anschließend die Wirtszelle infizieren zu können. Es handelt sich dabei um das verzweigte Tetrasaccharid GM2. Die Bindung von GM2 an T1L sigma 1 in Lösung wurde mittels STD NMR-Spektroskopie nachgewiesen. Zudem wurde die Kristallstruktur von T1L sigma 1 im Komplex mit GM2 gelöst. Anhand der Struktur wurden Aminosäuren identifiziert, die für die Zuckerbindung essentiell sind und es konnte erklärt werden, warum gerade GM2 von T1L sigma 1 selektiv gebunden wird. Basierend auf den strukturellen Daten kann nun nachvollzogen werden, warum GM2 nur von Serotyp 1 Reoviren erkannt wird. Außerdem liefert diese Arbeit grundlegende Einblicke in den Erkennungsprozess der Wirtszelle durch Viren. Neben Untersuchungen des C-terminalen Bereichs des sigma 1-Proteins und dessen Wechselwirkung mit Zuckerliganden wurde auch die N-terminale Region des Proteins strukturell analysiert. Strukturvorhersagen zufolge bildet dieser Bereich von sigma 1 ein trimeres alpha-helikales coiled coil, da die Aminosäuresequenz ein dafür charakteristisches Muster aufweist. Im Rahmen dieser Studie wurden die Kristallstrukturen zweier verschiedener Abschnitte dieser Domäne bestimmt. Beide Kristallstrukturen bestätigen das Vorliegen von coiled coils in diesen Bereichen. Des Weiteren wurden die Wechselwirkungen analysiert, die diese Strukturelemente stabilisieren. Basierend auf den Kristallstrukturen der N-terminalen Bereiche von T1L sigma 1 können nun chimäre Proteine generiert werden, in denen helikale Segmente anderer Proteine im Kontext von Reovirus sigma 1 eingefügt werden. Ein Beispiel für diese Anwendung ist die Insertion der A-Helix des Influenzavirusproteins Hämagglutinin, welche ein konserviertes Strukturelement in Influenzaviren darstellt. Reoviren, die die A-Helix in ihrem Kapsid präsentieren, könnten daher als Impfstoffe eingesetzt werden, um gezielt die Produktion von Antikörpern gegen dieses Strukturelement auszulösen und so dem Patienten einen breiten Schutz gegen Influenzaviren zu gewährleisten. Das zweite Projekt dieser Dissertation beinhaltete die Strukturaufklärung des Proteins GP42, einer TGase aus dem Pflanzenpathogen Phytophthora sojae. Die den Oomyceten angehörenden Phytophthora befallen eine Vielzahl an Pflanzen und richten dadurch einen hohen ökonomischen Schaden an. In allen bisher getesteten Phytophthora-Arten gibt es ein zu GP42 homologes Enzym. Ein 13 Aminosäuren langes Peptid des GP42, Pep-13, wird von Pflanzen als „fremd“ erkannt und löst daraufhin eine weitreichende Immunantwort aus. Die Kristallstruktur von GP42 zeigt, dass Pep-13 einen beta-Strang an der Oberfläche des Proteins bildet, wo es für Komponenten des Immunsystems der Pflanze teilweise zugänglich ist. Gemäß der Kristallstruktur wird das aktive Zentrum des Enzyms vermutlich durch die Aminosäuren Cys290, His291 und Asp328 gebildet. GP42 besitzt keinerlei Sequenzähnlichkeit zu bereits charakterisierten TGasen von Säugetieren oder Bakterien. Allerdings weist die Struktur im Kernbereich des Enzyms Ähnlichkeit zu Cysteinproteasen der Papainfamilie auf. Ein Vergleich der Sequenz von GP42 mit homologen Proteinen aus Oomyceten zeigt, dass sich die konservierten Reste um das aktive Zentrum der TGase häufen. Die Kristallstruktur von GP42 dient daher als Modellstruktur für verwandte Enzyme aus anderen Oomyceten. Eine Suche nach homologen Sequenzen außerhalb dieser taxonomischen Gruppe offenbarte eine unerwartete Sequenzhomologie zwischen GP42 und bestimmten Proteinen aus marinen Vibriobakterien. Eine evolutionäre Verwandtschaft dieser Bakterien und Phytophthora ist daher wahrscheinlich.