Parvovirus B19-assoziierte inflammatorische Kardiomyopathie: Dysregulation der inflammatorischen Signaltransduktion durch parvovirale Proteine

Abstract

Das humanpathogene Parvovirus B19 (B19V) wurde vor Kurzem als neu identifizierter Erreger entzündlicher Herzmuskelerkrankungen beschrieben. Die Infektion myokardialer Endothelzellen mit B19V kann mit einer endothelialen Dysfunktion und sekundärer Schädigung der Myozyten einhergehen, die zur inflammatorischen Kardiomyopathie (iCMP) führen kann. Das virale Effektorprotein NS1 des Parvovirus B19 ist essentiell für die Initiierung der viralen Replikation durch seine Helikase, Nickase- und ATPase-Aktivität. Die Überexpression von B19V-NS1 wirkt zytotoxisch und kann Apoptose induzieren. Molekulare Mechanismen, die zu einer Inflammation und der Entstehung einer B19V-iCMP führen können, sind bislang wenig verstanden. In der vorliegenden Arbeit wurde dementsprechend die inflammatorische Signaltransduktion, insbesondere der MAPK- und eNOS-Signalweg detailliert untersucht. Die durchgeführten Analysen haben gezeigt, dass B19V und B19V-NS1 in permissiven Megakaryozyten (UT-7/EPO) und semipermissiven Endothelzellen (hMEC-1) eine signifikante Dysregulation des MAPK-Signalwegs verursachen und insbesondere zu einer Aktivierung von p44/42-ERK und p38-MAPK führen kann. Durch Genexpres-sionsstudien konnte zudem eine Modulation von MAPK-assoziierten Genen beobachtet werden. Initiale Untersuchungen zum Einfluss von B19V-NS1 auf die Regulation des eNOS-Signalwegs zeigten eine starke Dysregulation von Zielgenen der eNOS-Signalgebung. Einen Effekt auf die Expression von eNOS konnte jedoch nicht gezeigt werden. Von Interesse war, auf welche Weise B19V-NS1 direkt oder indirekt in intrazelluläre Signalkaskaden eingreift. In Interaktionsstudien wurden elf direkte Bindungspartner von B19V-NS1 identifiziert, die mit pathophysiologischen und viralen Prozessen in Verbindung gebracht werden konnten. Die genetische Varianz von Parvoviren ist groß. Zudem haben Genmutationen Einfluss auf virale Prozesse und die klinische Manifestation einer Virusinfektion. Daher wurden patienten-spezifische B19V-Isolate auf Mutation in funktionellen Domänen von B19V-NS1 untersucht. Eine beschriebene Mutation (K334E), durch die B19V-NS1 seine zytotoxischen Eigenschaften verliert, konnte mit dem Fallbeispiel eines milden Krankheitsverlaufs assoziiert werden. Bei Untersuchungen zur Divergenz des B19V-Genoms fiel eine gesteigerte Variabilität des Genotyps 2 auf. Folgende Analysen der hypervariablen B19V-Region NS1-VP1u des Genotyps 2 resultierten in der Differenzierung von zwei genetischen Varianten 2a und 2b. Die Ergebnisse aus den Arbeiten zur vorliegenden Doktorarbeit belegen eine Dysregulation der MAPK-Signaltransduktion und der eNOS-Signalkaskaden durch B19V, wodurch pro-apoptotische und proinflammatorische Prozesse in Gang gesetzt werden, die die Entwicklung der B19V-assoziierten inflammatorischen Kardiomyopathie mit endothelialer Dysfunktion erklären helfen und künftig für innovative diagnostische und therapeutische Optionen einer B19V-iCMP eingesetzt werden können.

The human Parvovirus B19 (B19V) was recently identified as a potential pathogen and etiologic in inflammatory cardiomyopathy (iCMP). The infection of myocardial endothelial cells by B19V can come along with endothelial dysfunction and secondary injury of myocytes, which leads to an iCMP. The B19V effector protein NS1 is essential for initiating viral replication by its helicase, nickase and ATPase activity. The overexpression of B19V-NS1 is cytotoxic and can induce apoptosis. To date, molecular mechanisms, which lead to an inflammation and to the development of B19V-iCMP, are still poorly understood. Therefore, we investigated inflammatory signaling pathways, notably MAPK and eNOS signaling. Our studies showed , that B19V and B19V-NS1 caused a significant dysregulation of MAPK signaling pathways in permissive megakaryocytes (UT-7/EPO), as well as in semi-permissive endothelial cells (hMEC-1). This dysregulation includes especially activation of the kinases p44/42-ERK and p38-MAPK. Additionally, a modulation of MAPK-associated genes could be observed in gene expression arrays. Initial analysis of the influence of B19V-NS1 on regulation of eNOS signaling showed intense dysregulation of eNOS target genes. Interestingly, an influence of B19-NS1 on the expression of eNOS could not be found. In order to determine the way, in which B19-NS1 acts as a direct or indirect effector on the intracellular signaling cascade, we performed interaction studies and identified 11 B19-NS1 binding partners. These cellular proteins could be associated with pathophysiological and viral processes. Parvoviruses are genetically highly variable. Additionally, gen mutations influence viral processes and the clinical manifestation of a viral infection. Thus, B19V DNA of patients suffering from B19V infections was isolated and screened for mutations in functional domains. On the basis of a case study, a yet described mutation (K334E) causing a loss of cytotoxic features in B19V-NS1, could be associated with a mild clinical outcome. Whilst analysing the devergency of the B19V genome, genotype 2 variability seemed to be increased. Following investigation of the highly variable NS1-VP1u region of B19V genotype 2 resulted in the differentiation of two genetic variants 2a and 2b. The results of the analysis within this doctoral thesis prove a dysregulation of MAPK signaling transduction and the eNOS signaling cascade by B19V, which could lead to proapoptotic and proinflammatory processes. These findings can help to explain the development of B19V-associated inflammatory cardiomyopathy with endothelial dysfuction and could serve as a basis for future diagnostic and therapeutic options of B19V-iCMP.