Functional analysis of the ependymal marker protein Wdr16

Abstract

Wdr16 is a protein that is abundantly expressed in kinocilia-bearing tissues such as ependyma and testis and that was linked to ciliary function and hydrocephalus (Hirschner et al., 2007). The aim of the present PhD thesis was a molecular biological approach to contribute to the understanding of the molecular function and spatial structure of this protein. In order to achieve this goal, it was highly desirable to perform experiments by which the expression of the Wdr16 protein could be abolished or reduced in kinocilia-bearing cells and tissues. One method that was used for this purpose is the “knockdown” of wdr16 gene expression in EPCs using lentiviral gene transfer (Stewart et al., 2003). Another method employed is the generation of a transgenic Wdr16 “knockout” mice strain (Walinski, 2004). To achieve such an ambitious objective, it is important to establish basic techniques, e.g the cloning of a targeting vector, ES cell culture and the procedures for electroporation, and screening of the ES cells. A further objective of this PhD thesis was to study the cellular and subcellular location of Wdr16. This can be carried out by using immunohistochemical stainings as well as by expressing GFP- or Flag-tagged fusions of Wdr16 in EPCs or cell lines. Finally, another aim of this PhD thesis was the expression of Wdr16 in insect cells as a prerequisite for the purification of the protein by affinity chromoatography. The purified protein then has to be subjected to CD analysis in order to determine its secondary structure. The availability of a purified protein would also facilitate, among other things, the determination of the crystal structure of Wdr16, production of a new polyclonal antibody, and the search for protein interaction partners using “pull down” assays. The search for binding partners of Wdr16 (using Co-IP) was also a topic of this thesis since the identification of a binding partner can instantly provide valuable information about the molecular function of a gene product.

Wdr16 ist ein Eiweißkörper, welcher in Kinozilien-tragenden Geweben wie dem Ependym und den Hoden hergestellt wird und welcher mit der Funktion von Kinozilien und der Entstehung des Wasserkopfes (Hydrocephalus) in Verbindung gebracht wird (Hirschner et al., 2007). Das Ziel der vorliegenden Doktorarbeit war ein molekularbiologischer Ansatz, welcher zum Verständnis der molekularen Funktion und räumlichen Struktur dieses Proteins beiträgt. Um dieses Ziel zu erreichen war es notwendig Experimente durchzuführen, durch welche die Herstellung von Wdr16 in Kinozilien-tragenden Zellen und Geweben gänzlich abgeschaltet oder reduziert wird. Eine dafür eingesetzte Methode ist der „Knockdown“ von Wdr16 in EPCs mittels lentiviralem Gentransfer (Stewart et al., 2003). Eine andere verwendete Methode ist die Herstellung einer transgenen Wdr16 „knockout“-Mauslinie. Um dieses Ziel zu erreichen ist es wichtig, grundlegende Techniken zu etablieren, z.B. die Klonierung eines „Targeting“-Vektors sowie Kultur, Elektroporation und Screening von embryonalen Maus-Stammzellen. Ein weiteres Ziel der Doktorarbeit war es die zelluläre und subzelluläre Verteilung von Wdr16 zu untersuchen. Dies kann entweder direkt durch immunohistochemische Färbungen oder auch durch die Expression von GFP- oder Flag-markierten Fusionsproteinen in EPCs oder verschiedenen Zelllinien erreicht werden. Schließlich war es Ziel der Dissertation Wdr16 in Insektenzellen herzustellen, um es danach mittels Affinitätschromatographie isolieren zu können. Das isolierte Protein kann dann mittels CD-Spektroskopie analysiert werden, um seine Sekundärstruktur zu bestimmen. Das Vorliegen des isolierten Proteins würde unter anderem auch die Bestimmung der Kristallstruktur, die Herstellung eines polyklonalen Antikörpers und die Suche nach Protein-Interaktionspartnern mit Hilfe von „pull down“-Experimenten vereinfachen. Die Suche nach Bindungspartnern des Wdr16-Proteins mittels Ko-Immunpräzipitation war auch ein Thema der Doktorarbeit, da deren Identifikation wertvolle Hinweise über die molekulare Funktion des Proteins geben kann.