Function and Regulation of Na+/ H+ Exchanger in Dendritic Cells

Abstract

Dendritic cells (DCs) are specialised antigen presenting cells, linking innate and adaptive immunity. They are stimulated by bacterial lipopolysaccharides (LPS), which trigger the formation of reactive oxygen species (ROS). In macrophages, ROS formation is paralleled by the activation of the Na+/H+ exchanger, a transporter involved in the regulation of cytosolic pH and cell volume. The present study was undertaken to unravel the possible role of Na+/H+ exchanger in the activation of DCs. In the first step, using quantitative real time PCR analysis the expression of Na+/H+ exchanger (NHE) isoforms in bone marrow-derived mouse DCs was analysed. The expression of NHE1 was highest among the various isoforms known to be localised in the cell membrane, so the study focussed on the functional significance of NHE1 isoform. Exposure of DCs to LPS, within 4 hours led to a gradual cytosolic acidification paralleled by a transient time and dose dependent increase of Na+/H+ exchanger activity. Moreover, LPS increased forward scatter in FACS, reflecting increase of cell volume, enhanced ROS formation, decreased apoptosis and stimulated release of TNF-alpha. An NHE1 inhibitor cariporide (10 µM) significantly blunted the effects of LPS on Na+/H+ exchanger activity, on cell swelling, on ROS formation, on TNF-alpha secretion as well as antiapoptotic effect of LPS. Na+/H+ exchanger activity was stimulated by oxidative stress as induced by tert-butyl-hydroperoxide (10 µM) and LPS induced stimulation of NHE activity was abolished in the presence of ROS chelators (Tempol, Tiron and Vitamin C). These data indicate that LPS treatment leads to ROS formation, which in turn leads to transient upregulation of the Na+/H+ exchanger in DCs. On the other hand, upregulation of Na+/H+ exchanger is required for the effects of LPS on DC survival, cell volume and ROS formation. The function of DCs is regulated by the phosphoinositide 3 (PI3)-kinase pathway. On the other hand, PI3-kinase is an important regulator of diverse transporters including the Na+/H+ exchangers (NHE). The next step of this study was to elucidate the role of PI3-kinase in regulation of NHE activity, cell volume, ROS formation and migration. LPS-induced upregulation of Na+/H+ exchanger activity, cell swelling, enhancement of ROS production and stimulation of migration were all significantly blunted by PI3K inhibitors Wortmannin (1 µM) or LY294002 (10 µM) . The present observations disclose a critical role of PI3K signalling in the regulation of DC function following exposure to LPS. The oxidative stress responsive kinase 1 (OSR1) is activated by WNK (with no K kinases) and in turn stimulates the thiazidesensitive Na-Cl cotransporter (NCC) and the furosemide sensitive Na-K-2Cl cotransporter (NKCC) thus contributing to transport and cell volume regulation. Little is known about extrarenal functions of OSR1. The present study analysed the impact of decreased OSR1 activity on the function of DCs. For this purpose, DCs were isolated from bone marrow of heterozygous WNK resistant OSR1 knock in mice (osrKI) and wild type mice (osrWT). DCs express WNK1, WNK3, NCC, NKCC1 and OSR1. NKCC1 phosphorylation was reduced in osrKI DCs. Cell volume and cytosolic pH were similar in osrKI and osrWT DCs, but Na+/H+ exchanger-activity and ROS-production were higher in osrKI compared to osrWTDCs. Prior to LPS treatment, migration was similar in osrKI and osrWT DCs. LPS (1 µg/ml), however, increased the migration of osrWT DCs but not of osrKI DCs. NHE1 inhibitor cariporide (10 µM), which virtually abrogated Na+/H+ exchanger activity in both genotypes, decreased cell volume, intracellular ROS formation, and cytosolic pH to a greater extent in osrKI than in osrWT DCs. LPS increased cell volume, Na+/H+ exchanger activity, and ROS-formation in osrWTDCs but not in osrKIDCs and blunted the difference between osrKI and osrWT DCs. Na+/H+ exchanger activity in osrWT DCs was increased by NKCC1 inhibitor furosemide (100 nM) to values similar to those in osrKI DCs. Oxidative stress (induced by 10 µM tert-butyl-hydroperoxide) increased Na+/H+ exchanger activity in osrWT DCs but not in osrKI DCs and reversed the differences between the genotypes. Cariporide blunted LPS induced cell swelling and ROS formation in osrWT DCs. In conclusion, partial OSR1 deficiency influences Na+/H+-exchanger-activity, ROS-formation and migration of dendritic cells.

Dendritische Zellen (DZ) sind spezialisierte, Antigen-präsentierende Zellen, die angeborene und erworbene Immunität verbinden. Sie werden durch bakterielle Lipopolysaccharide (LPS) stimuliert, was zur Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) führt. In Makrophagen führt die Bildung von ROS zu einer Aktivierung des Na+/H+-Austauschers, eines Transportproteins, das an der Regulation des cytosolischen pH-Wertes und des Zellvolumens beteiligt ist. Die vorliegende Arbeit wurde durchgeführt, um die mögliche Rolle des Na+/H+ Austauschers bei der Aktivierung von DZ zu untersuchen. Im ersten Schritt wurde mit Hilfe der Real Time PCR die Expression der Isoformen des Na+/H+ Austauschers in DZ analysiert. Von den verschiedenen Isoformen die in der Zellmembran exprimiert werden, war die Expression des NHE1 am höchsten, weshalb sich diese Studie auf die funktionale Signifikanz der NHE1-Isoform konzentriert. Die Behandlung der DZ mit LPS führte innerhalb von 4 Stunden zu einer schrittweisen cytosolischen Ansäuerung begleitet von einem zeit- und dosisabhängigen Anstieg der Aktivität des Na+/H+-Austauschers. Außerdem führte die Behandlung mit LPS zu einem Anstieg des Vorwärtsstreulichtsignals bei der Durchflusszytometrie was die Erhöhung des Zellvolumens zeigt, des weiteren zu vermehrter ROS-Bildung, verminderter Apoptose und einer erhöhten Freisetzung von TNF-alpha. Der NHE1-Inhibitor Cariporid (10 µM) hob die Effekte von LPS auf die Na+/H+-Austauscher-Aktivität, auf das Zellvolumen, auf die Bildung von ROS, auf die TNF-alpha Sekretion und auch auf die antiapoptotischen Effekte von LPS auf. Die Aktivität des Na+/H+-Austauschers wurde durch oxidativen Stress (induziert durch 10 µM Tert-butyl-hydroperoxid) stimuliert und eine durch LPS hervorgerufene Stimulation der NHE-Aktivität wurde in Gegenwart von ROS-Chelatoren (Tempol, Tiron und Vitamin C) aufgehoben. Abschließend lässt sich sagen, dass die Behandlung mit LPS zur Bildung von ROS führt, was wiederum eine vorübergehende Hochregulierung des Na+/H+ Austauschers in DZ zur Folge hat. Eine Hochregulierung des Na+/H+ Austauschers ist ebenfalls erforderlich für die Effekte von LPS auf das Überleben von DZ, das Zellvolumen und die Bildung von ROS. Die Funktion von DZ wird durch den Phosphoinositol 3 (PI3)-kinase Signalweg reguliert. Zudem ist die PI3-kinase ein wichtiger Regulator diverser Transporter einschließlich des Na+/H+ Austauschers (NHE). Im nächsten Schritt dieser Arbeit soll die Rolle der PI3-kinase bei der Regulation der NHE Aktivität, des Zellvolumens, der Bildung von ROS und der Migration aufgeklärt werden. LPS-induzierte Effekte wie der Anstieg der Na+/H+-Austauscher-Aktivität, die Zunahme des Zellvolumens, die Steigerung der Bildung von ROS sowie die Stimulation der Migration wurden durch die PI3K Inhibitoren Wortmannin (1 µM) oder LY294002 (10 µM) signifikant reduziert. Die vorliegenden Beobachtungen weisen auf eine kritische Rolle des PI3K-Signalweges bei der Regulation der Funktion von DZ nach Behandlung mit LPS hin. Die oxidative-stress-responsive-kinase 1 (OSR1) wird durch den WNK (with no K kinases) Signalweg aktiviert und stimuliert ihrerseits die Thiazid-sensitiven Na-Cl Kotransporter (NCC) und die Furosemid-sensitiven Na-K-2Cl Kotransporter (NKCC) und trägt so zur Regulation des Elektolyttransportes und des Zellvolumens bei. Es ist wenig über extrarenale Funktionen von OSR1 bekannt. Die vorliegende Studie beschäftigt sich mit dem Einfluss von verminderter OSR1-Aktivität auf die Funktion von DZ. Dafür wurden DZ aus dem Knochenmark von heterozygoten, WNK-resistenten OSR1 knockin Mäusen (osrKI) und Wildtyp Mäusen (osrWT) gewonnen. Die DZ zeigten die Expression von WNK1, WNK3, NCC, NKCC1 und OSR1. Die NKCC1 in den osrKIDZ zeigten weniger Phosphorylierung. Das Zellvolumen und der cytosolische pH-Wert waren ähnlich in den osrKI und osrWTDZ, aber sowohl die Aktivität des Na+/H+ Austauschers als auch die Bildung von ROS waren in den osrKIDZ stärker erhöht als in den osrWTDZ. Vor der Behandlung mit LPS war das Migrationsverhalten von osrKI und osrWTDZ ähnlich. LPS (1µg/ml) führte jedoch zu einem Anstieg der Migration bei den osrWTDZ, nicht jedoch bei den osrKIDZ. Der NHE1-Inhibitor Cariporide (10µM), der die Aktivität des Na+/H+-Austauschers in beiden Genotypen nahezu aufhob, ließ in osrKI DZ das Zellvolumen stärker abnehmen als in osrWTDZ und erniedrigte auch deutlicher die intrazelluläre ROS-Produktion, und den cytosolischen pH-Wert. Die Behandlung mit LPS führte zu einem Anstieg des Zellvolumens, der Na+/H+-Austauscher-Aktivität, und der ROS-Produktion in osrWTDZ jedoch nicht in osrKIDZ und hob die Unterschiede zwischen osrKI and osrWTDZ auf. Die Na+/H+-Austauscher-Aktivität in den osrWTDZ wurde durch den NKCC1-Inhibitor Furosemid (100 nM) auf Werte ähnlich denen der osrKIDZ erhöht. Oxidativer Stress (10 µM Tert-butyl-hydroperoxid) erhöhte die Na+/H+ Austauscher-Aktivität in den osrWTDZ aber nicht in den osrKIDZ und revidierte den Unterschied zwischen den Genotypen. Die Behandlung mit Cariporide kehrte den LPS-vermittelten Anstieg des Zellvolumens und der ROS Produktion in osrWT DZ um. Daraus lässt sich schließen, dass eine partielle OSR1 Defizienz die Na+/H+ Austauscher Aktivität, die ROS-Bildung und die Migration von dendritischen Zellen beeinflusst.