New Players in Platelet Activation and Apoptosis

Abstract

The non-nucleated platelets are the key players in thrombosis and haemostasis and versatile mediators of inflammation and immunity. Their life, death and actions define illness and health of men. This dissertation attempted to find what events lead to the apoptotic death in platelets by nutraceutical thymoquinone, pathogen-associated peptidoglycan, the antibiotic vancomycin and finally how platelet activation and death by a recently reported chemokine CXCL16 influence platelet function. Thymoquinone triggers suicidal death of blood platelets in a Phosphoinositide 3Kinase-dependent manner, possibly through a G-protein Coupled Receptor family opioid receptor; an effect paralleled by increase of cytosolic Ca(2+) activity, ceramide formation, mitochondrial depolarization, and caspase-3 activation. HPLC-purified fractions of peptidoglycan from Staphylococcus aureus 113 triggers apoptosis of platelets, characterized by annexin-V binding, increase of [Ca2+]i, mitochondrial depolarization, caspase-3 activation and integrin alphaIIbbeta3 upregulation. The annexin-V binding was significantly blunted by anti-TLR-2 antibodies, in the absence of extracellular Ca2+ and by pancaspase inhibitor zVAD-FMK (1 µM). Vancomycin decreased cell volume, triggered annexin V-binding, stimulated ceramide formation and activated caspase 3. The annexin V-binding was significantly blunted by removal of extracellular Ca2+ but not by pan-caspase inhibition with zVAD-FMK (1µM). Vancomycin also triggers thromboxane B2 release from platelets in cyclooxygenase dependent way. The chemokine CXCL16 significantly up-regulated expression of P-selectin and activated integrin alphaIIbbeta3 at the platelet surface. Consistent with these findings the effects of CXCL16 on platelet activation were inhibited by PI3K inhibitors wortmannin and LY294002 as well as by Akt inhibitor SH-6 (20 µM). The stimulation of adhesion by CXCL16 was again prevented by wortmannin, LY294002 and SH-6. Apyrase and inhibition of the platelet purinergic receptors P2Y1 (MRS2179, 100 µM) and especially P2Y12 (Cangrelor, 10 µM) blunted CXCL16-triggered platelet activation as well as CXCL-16-induced platelet adhesion under high arterial shear stress in vitro indicating that CXCL16 activates platelets via ADP release-dependent paracrine activation. In conclusion the inflammatory chemokine CXCL16 triggers platelet activation and adhesion via PI3K/Akt signaling pathway and paracrine activation suggesting a decisive role for CXCL16 in the pathogenesis of atherosclerosis and thrombo-occlusive diseases.

Thrombozyten spielen sowohl in thrombotischen und hämostatischen Prozessen eine wesentliche Rolle als auch in entzündlichen sowie Immunreaktionen. Für die Gesundheit des Menschen sind sie von essentieller Bedeutung. Im Rahmen dieser Doktorarbeit konnte herausgefunden werden, welche Ereignisse in Thrombozyten bei Kontakt mit dem Nahrungsergänzungsmittel Thymoquinone, dem Pathogen-assoziierten Peptidoglycan und dem Antibiotikum Vancomycin zu programmiertem Zellungergang führen und wodurch das Chemokin CXCL-16 Einfluss auf die Plättchenfunktion hat. Thymoquinone löst in Thrombozyten PI3-Kinase-abhängig und downstream eines G-Proteins Apoptose aus, wodurch es zu einer gesteigerten intrazellulären Ca2+-Menge, zu erhöhter Ceramidbildung, zu mitochondrialen Depolarization sowie zur Aktivierung von Caspase-3 kommt. HPLC-gereinigte Fraktionen von Peptidoglycan aus Staphylococcus aureus 113 führt in Blutplättchen zur Annexin-V-Bindung, dadurch zu einer Erhöhung der [Ca2+]i, zu mitochondriale Depolarisation sowie zu Caspase-3-Aktivierung und Integrin alphaIIbbeta33-Hochregulation. Die Annexin-V-Bindung wurde durch anti-TLR-2-Antikörper, die Abwesenheit von extrazellulärem Ca2+ sowie durch den Pan-Caspase-Inhibitor zVAD-FMK signifikant reduziert. Ebenso verringert Vancomycin das Zellvolumen, triggert die Annexin V-Bindung, stimuliert die Bildung von Cerabid sowie von aktiver Caspase-3. Die Bindung von Annexin V konnte mittels des Pan-Caspase-Inhibitors zVAD-FMK sowie durch die Entfernung von [Ca2+]e erfolgreich verhindert werden. Zusätzlich triggert Vancomycin abhängig von p38 MAPK und der Cyclooxygenase die Thromboxan B2-Freisetzung aus Thrombozyten. Das Chemokin CXCL16 reguliert die Expression von P-Selektin hoch und aktiviert Integrin alphaIIbbeta3 an der Plättchenoberfläche. Mit diesen Ergebnissen kohärent ist die Inhibition der beschriebenen Auswirkungen von CXCL16 sowie dessen Adhäsion durch die PI3K-Inhibitoren Wortmannin und LY294002 sowie durch den Akt Inhibitor SH-6. Die Inhibition des P2Y1 sowie des P2Y12-Rezeptors führte zu einer deutlichen Abnahme der CXCL16-induzierten Plättchenadhäsion bei hoher Flussrate in vitro, wodurch die Schlussfolgerung zulässig ist, dass CXCL16 Plättchen ADP-abhängig parakrin aktiviert. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass CXCL16 Plättchen mittels PI3K-Akt sowie parakriner Prozesse aktiviert und dadurch eine maßgebliche Rolle in der Pathogenese von Atherosklerose sowie thombo-okklusiven Erkrankungen spielt.