Mycobacterium tuberculosis Antigen Arrays for the in-depth Characterization of the Serological Response of TB Infected Patient Cohorts

Abstract

In this thesis, a bead based multiplexed serological antigen assay was generated, optimized and validated for the detection of human antibodies in serum of patients infected with tuberculosis.

To ensure reliable and comparable results of the developed assay over a longer period of time quality control samples are always necessary. For the first time, a systematic bioinformatics approach was described to create a pool of serum samples that can be used as quality and positive controls in a multiplexed assay setup to cover all analytes with pre-calculated signal intensities. Using this approach, reference samples for several thousand screenings could be generated with only minimal consumption of sample material.

Screening of more than thousand human serum samples revealed a set of antigens which was able to discriminate different tuberculosis disease states. However, statistical analysis showed a poor sensitivity and specificity of the identified markers. A combination of these antigens did not lead to an improved sensitivity and specificity.

In summary, this study shows that the developed assay based on the available material and considering the complex nature of the disease is not able to clearly discriminate different tuberculosis disease states. However, the identified candidate antigens are promising for future work (e.g. the results generated by Kunnath-Velayudhan et al., 2010 [81] were confirmed) but further studies are necessary. The assay described here can be used as an excellent research tool to gain further insight into the endemic and demographic properties of the disease. Thus, in the near future, endemic studies are planned to get an overview if different patterns of antibody reactivity can be observed. Detection of childhood tuberculosis is a very challenging task, as the results with current diagnostics (sputum smear microscopy and culture) often show false-negative results. Therefore, a rapid and specific serological test would also improve the medical care of tuberculosis in children. This opens an additional research area where the assay developed during this thesis can serve as a promising research tool.

In dieser Arbeit wurde ein Bead-basierter multiplexer serologischer Assay zur Detektion von humanen Antikörpern in Serum von mit Tuberkulose infizierten Patienten entwickelt, optimiert und validiert.

Um mit dem entwickelten Assay über einen längeren Zeitraum zuverlässige und vergleichbare Ergebnisse gewährleisten zu können, ist der Einsatz von Qualitätskontrollen notwendig. Erstmalig wurde ein systematischer bioinformatischer Ansatz zur Herstellung eines Probenpools beschrieben, der als Qualitäts- und Positivkontrolle in diesem multiplexen Assay verwendet werden kann. Hierdurch war es möglich Referenzproben für mehrere tausend Messungen herzustellen, für die nur sehr geringe Mengen an Probenmaterial eingesetzt werden mussten.

Die Analyse von mehr als eintausend humanen Serumproben ergab ein Set von Antigenen, das zwischen verschiedenen Krankheitszuständen bei Tuberkulose unterscheiden kann. Jedoch zeigte eine statistische Analyse der Daten eine schlechte Sensitivität und Spezifität der identifizierten Marker. Auch eine Kombination dieser identifizierten Antigene führte zu keiner verbesserten Sensitivität und Spezifität des Tests.

Zusammenfassend zeigt diese Studie, dass der entwickelte Assay mit dem verwendeten Material und aufgrund der komplexen Natur der Krankheit nicht zwischen verschiedenen Krankheitszuständen der Tuberkulose unterscheiden kann. Trotzdem erwiesen sich die identifizierten Antigene als vielversprechend (so konnten zum Beispiel die Ergebnisse von Kunnath-Velayudhan et al., 2010 [81] bestätigt werden), jedoch sind hierzu weitere Studien notwendig. Der hier entwickelte Test kann als Forschungswerkzeug für weitere Studien herangezogen werden, um einen besseren Einblick in die endemischen und demographischen Unterschiede dieser Krankheit zu bekommen. In naher Zukunft sind hierfür endemische Studien geplant um eine Übersicht über verschiedene Muster der Immunantwort zu bekommen. Auch die Detektion von Tuberkulose bei Kindern ist eine große Herausforderung, da die aktuellen diagnostischen Verfahren (Mikroskopie und Kultur) oft falsch-negative Ergebnisse liefern. Ein schneller und spezifischer serologischer Test würde somit auch die medizinische Versorgung bei mit Tuberkulose infizierten Kindern erheblich verbessern.