Immuntherapeutische Ansätze beim Rhabdomyosarkom: Therapeutische Antikörper und Phagozytose

Abstract

Neue immuntherapeutische Behandlungsansätze bei Krebs werden derzeit intensiv erforscht. Die Entwicklung einer Antikörpertherapie setzt neben der Auswahl geeigneter Antigene auch die Identifikation therapeutisch wirksamer Antikörper sowie ein Mausmodell zur Überprüfung effizienter Therapiestrategien in vivo voraus. Bislang sind beim Rhabdomyosarkom (RMS) keine spezifischen Zielstrukturen oder therapeutische Antikörper zur Optimierung vorhandener Therapieverfahren erprobt.

Nach einer Genexpressionsanalyse von RMS-Geweben wurde EGFR als therapeutisches Target ausgewählt und dessen Expression auch auf RMS-Zelllinien nachgewiesen. Mit dem EGFR-bindenden therapeutischen Antikörper Cetuximab wurde eine wirksame ADCC-Aktivität und eine effektive Lyse der RMS-Zellen in vitro aufgezeigt. Monoklonale Antikörper, hergestellt durch Immunisierung von Mäusen mit Gewebeproben aus kindlichen Tumoren, wurden auf ihre Bindungsspezifität an RMS-Zellen und -Gewebe charakterisiert. Der Antikörper 58B1A2 zeichnet sich durch eine hohe Affinität zu malignen RMS-Tumoren aus. Sein unbekanntes Antigen konnte weder durch Western-Blots noch durch Immunpräzipitationen und anschließende LC/MS-Analysen identifiziert werden. Um ein breiteres Ansprechen des Immunsystems durch die Aktivierung von Phagozytose zu erlangen, wurden CD47 und Calreticulin moduliert. Für beide Zielstrukturen wurde eine hohe intrazelluläre Expression in RMS-Zellen und -Geweben beobachtet. Eine bioregulatorische Bedeutung des CD47-Antikörpers in Form einer verhinderten Inhibition der Phagozytose konnte beim RMS nicht bestätigt werden. Allerdings wurde durch das Zytostatikum Doxorubicin ein Transport des Makrophagen-Aktivators Calreticulin an die Oberfläche der RMS-Zellen mit einer damit verbundenen effizienten Phagozytose in vitro dokumentiert. Darüber hinaus wurden verschiedene in vivo Monitoring-Methoden für das Mausmodell des metastasierenden RMS etabliert und validiert. Als qualitativer Parameter des Tumorwachstums hat sich die Bestimmung der GLuc-Aktivität im Plasma der Tiere bewährt. Im Falle der Tumorlokalisation wurden bei der optischen Bildgebung mittels Fluoreszenz und Biolumineszenz Defizite wahrgenommen. Diese konnten jedoch in einer PET/MRT-Messung mit dem radioaktiven Tracer [18F]FLT ausgeräumt werden.

Die im Rahmen dieser Doktorarbeit erzielten Erkenntnisse über eine Immuntherapie mit Antikörpern beim RMS scheinen vielversprechend. Überdies unterstützen die Vorarbeiten zum Mausmodell die weitere Entwicklung neuer Behandlungsstrategien.

New immunotherapeutic treatment approaches to cancer are being investigated intensely. The development of an antibody therapy requires selection of appropriate antigens, identification of therapeutic active antibodies, and a mouse model to monitor effective therapeutic strategies in vivo. No specific targets or therapeutic antibodies are known for therapy optimization in rhabdomyosarcoma (RMS) by now.

EGFR was selected as therapeutic target after gene expression analysis of RMS tissues and its expression was also demonstrated on RMS cell lines. An effective ADCC activity and lysis of RMS cells was shown in vitro with the EGFR-binding therapeutic antibody cetuximab. Binding specificity of monoclonal antibodies, made by immunization of mice with tissue extracts of pediatric tumors, was characterized to RMS cells and tissues. The antibody 58B1A2 stood out due to a high affinity to malignant RMS tumors. It’s unknown antigen was neither identified by western blotting nor by immunoprecipitation and following LC-MS-analysis. CD47 and calreticulin were modulated to achieve a broader recruitment of effector mechanisms by activating phagocytosis. A high intracellular expression in RMS cells and tissues was observed for both targets. A bioregulatory function of CD47 antibody by avoiding inhibition of phagocytosis was not verified for RMS. However, transport of macrophage activating protein calreticulin on the cell surface of RMS cells connected with an efficient phagocytosis in vitro was documented. In addition, different in vivo monitoring methods were established and evaluated for the metastatic mouse model of RMS. Determination of GLuc-activity in animal plasma has proven itself as qualitative parameter of tumor growth. In case of tumor localization, shortfalls were noticed in optical imaging using fluorescence and bioluminescence. Those were smoothed out in a PET/MRI-measurement with the radioactive tracer [18F]FLT.

The results gained in this doctoral thesis about immunotherapy with antibodies in RMS show promise. Besides, this preliminary work on metastatic mouse model support the further development of new treatment strategies.