Characterisation of the Role of LysM Receptor-Like Kinases and the CHIA Chitinase in the Perception of Peptidoglycan and in the Innate Immunity of Arabidopsis thaliana

Abstract

Plants as sessile organisms cannot escape, when they are confronted with harmful pathogens. Instead, they are weaponed with sophisticated and highly complex molecular responses that allow them to defend themselves. The innate immunity forms the basis for the self-defense of higher organisms, including mammals, invertebrates and plants. During the basal immune response, conserved microbial signatures are perceived by pattern recognition receptors and trigger a variety of defense reactions leading to protection of the plant tissue and resistance. The bacterial cell wall component peptidoglycan (PGN) is one of such conserved signatures activating the plant defense responses, however the molecular mechanisms of its recognition was until now not understood. The importance of LysM-domain containing plant proteins in the recognition of carbohydrate ligands, such as chitin and lipochitooligosaccharides, has been elucidated in the last years. Due to the structural similarities between chitin, lipochitooligosaccharide and peptidoglycan, members of this protein family provide interesting candidates for a putative PGN receptor. The reverse genetics approach performed in this work revealed a LysM receptor kinase, CERK1, to be involved in PGN perception. CERK1 is not only essential for the PGN-mediated activation of defense responses in Arabidopsis thaliana, it also contributes to bacterial resistance. Consequently, CERK1 is a dual player within plant immunity, as it is important for both the recognition of carbohydrate signatures derived of both fungi and bacteria. The in parallel identified LysM protein, LYM3, binds PGN and is also essential for PGN-responsiveness and bacterial resistance. As LYM3 lacks a signaling domain the obtained data suggest that CERK1 and LYM3 form a functional receptor complex and are both needed for PGN-triggered immunity towards bacterial infection. The second focus of this work was to analyse the possible PGN processing properties of Arabidopsis. Studies on analogous, complex polymeric ligands, like fungal chitin and oomycete ß-glucan and the corresponding perception systems in plants, but also peptidoglycan perception in animals gave indications for such processing events. In addition, both complex and fragmented peptidoglycans act immunostimulatory in Arabidopsis, and are recognised by the same CERK1/LYM3-based receptor system. Therefore, the class III chitinase CHIA, a putative PGN hydrolase, was analysed regarding its role in peptidoglycan degradation and bacterial immunity. CHIA possesses both chitinolytic and peptidoglycan-hydrolysing activity, as observed with CHIA-oe leaf protein extracts but also with protein derived from the secreted fraction of CHIA-oe protoplasts. Both Gram-positive and Gram-negative peptidoglycan subtypes can be cleaved by CHIA. The posttranslational glycosylation and apoplastic localisation of CHIA depend on the N-terminal secretion signal. Absence or excess of CHIA-dependent PGN hydrolysis affects the plant defense response towards bacterial pathogens in a negative manner, suggesting that CHIA is a plant innate immunity protein contributing to bacterial resistance.

Pflanzen sind sessile Organismen und können daher nicht vor schädigenden Pathogenen flüchten. Stattdessen sind sie mit raffinierten und hochkomplexen zellulären Mechanismen bewaffnet, die es ihnen ermöglichen sich zu wehren. Die angeborene Immunität bildet dabei die Grundlage für die Selbstverteidigung von höheren Organismen, wie Säugetieren, Invertebraten und Pflanzen. Während der basalen Immunantwort werden hochkonservierte mikrobielle Signaturen von Mustererkennungsrezeptoren (PRR, „pattern recognition receptor“) erkannt und eine Reihe von Abwehrreaktionen ausgelöst, die die Pflanze vor Schäden schützen und den Pathogenangriff abwehren. Peptidoglycan (PGN) ist als Bestandteil der bakteriellen Zellwand eine solche konservierte Signatur, die in der Lage ist die pflanzliche Abwehrantwort zu aktivieren. Allerdings sind die molekularen Mechanismen, die zu der Erkennung von PGN führen noch weitgehend unerforscht. Die Bedeutung von pflanzlichen Proteinen mit LysM-Domänen in der Erkennung von kohlenhydrathaltigen Liganden, wie Chitin und Lipochitooligosacchariden, wurde in den letzten Jahren belegt . Aufgrund der ähnlichen Struktur von Chitin, Lipochitooligosacchariden und Peptidoglycan liefern die Mitglieder dieser Protein-Familie interessante Kandidaten für einen möglichen PGN-Rezeptor. Während dieser Arbeit konnte mit einem Reversen Genetik-Ansatz der LysM-Rezeptor Kinase, CERK1, eine Rolle in der Peptidoglycan Perzeption zugeschrieben werden. CERK1 ist nicht nur notwendig für die PGN-vermittelte Aktivierung von Abwehrreaktionen in Arabidopsis thaliana, sondern auch für die bakterielle Resistenz. Somit ist CERK1 ein dualer Spieler der pflanzlichen Immunität, da es bedeutsam für die Erkennung von Kohlenhydrat-Signaturen sowohl pilzlichen als auch bakteriellen Ursprungs ist. Das zeitgleich identifizierte LysM Protein, LYM3, bindet PGN und ist ebenfalls sowohl für die PGN-Erkennung als auch für die bakterielle Resistenz unabdingbar. Da LYM3 eine Signaltransduktionsdomäne fehlt, deuten die Ergebnisse auf einen funktionellen Komplex aus CERK1 und LYM3, wobei beide für die von PGN ausgelöste Immunität gegen bakterielle Erreger essentiell sind. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde Fokus auf die PGN Prozessierung in Arabidopsis gelegt. Studien an analogen und ähnlich komplexen polymeren Liganden, wie zum Beispiel Chitin aus Pilzen und ß-Glucan aus Oomyceten, und den dazugehörigen pflanzlichen Erkennungssystemen, aber auch der PGN-Perzeption der Tieren lieferten Indizien für solche Prozessierungsvorgänge. Darüber hinaus stimulieren sowohl komplexes als auch fragmentiertes Peptidoglycan die Immunantwort in Arabidopsis und beides wird über das gleiche CERK1/LYM3-Rezeptorsystem erkannt. Deshalb wurde die Klasse III Chitinase CHIA, eine putative PGN Hydrolase, hinsichtlich einer möglichen Rolle in der Peptidoglycan-Degradierung und der bakteriellen Immunität untersucht. CHIA besitzt sowohl chitinolytische als auch PGN-hydrolytische Aktivität. Diese Aktivität wurde in Proteinextrakten aus Blättern und auch der sekretierten Fraktion von Protoplasten von CHIA überexprimierenden Arabidopsis Pflanzen detektiert. Beide Subtypen von PGN, Gram-positiv und Gram-negativ, können von CHIA hydrolysiert werden. Die posttranslationelle Glykosylierung von CHIA und deren Sekretion in den Apoplasten sind abhängig von der N-terminalen Signalsequenz. Des Weiteren hat die Abwesenheit oder das Übermaß der CHIA-vermittelten PGN-Hydrolyse einen negativen Einfluss auf die pflanzliche Abwehr gegenüber bakteriellen Pathogenen. Infolgedessen gehört auch CHIA zu den Proteinen der angeborenen Immunität und trägt zur bakteriellen Resistenz bei.