Pharmacogenetic Determinants of Atorvastatin Metabolism and Response

Abstract

High levels of LDL-cholesterol are associated with an increased risk for atherosclerosis and cardiovascular events. Atorvastatin is a very effective HMG-CoA reductase inhibitor successfully lowering LDL-cholesterol and the risk for cardiovascular events. Statins are tolerated well by the majority of patients but low efficacy and adverse events, like myopathy, rhabdomyolysis, or hepatotoxicity, are well documented. Recent reports point to an involvement of certain metabolites of atorvastatin in the development of myopathy. Atorvastatin-lactone was increased in patients suffering from atorvastatin-induced myopathy.

Therefore this study focused on the identification of genetic variability, which might increase the plasma-level of atorvastatin-lactone. First, this work, via correlation analyses of quantitative protein and mRNA expression data of the candidate genes UGT1A1 and UGT1A3 with lactonization of atorvastatin in human liver microsomes, identified UGT1A3 as the most important enzyme in atorvastatin lactone formation. Additionally, a high population-variability was observed for this activity, as well as, for UGT1A3 expression. Hence, UGT1A3 was genotyped to investigate whether polymorphisms might explain this variability. The common UGT1A3*2 allele was associated with significantly increased mRNA and protein expression of UGT1A3 and increased formation of atorvastatin-lactone. Retrospective genotyping of healthy volunteers having received a single dose of atorvastatin revealed a significantly increased AUC ratio of atorvastatin-lactone to -acid in UGT1A3*2 carriers, which confirmed the in vitro observations of increased lactonization of this genotype.

In the second part, this work concentrated on the reverse process, the hydrolysis of atorvastatin-lactone, which also influences the levels of this metabolite. Quantitative protein and mRNA expression data of two candidates were generated and correlated with the hydrolysis of atorvastatin-lactone. In this way, PON1 and PON3 were identified as the enzymes most probably responsible for the hydrolysis of atorvastatin-lactone. Intensive genotyping within the PON-locus and association studies with the hydrolysis of atorvastatin-lactone were performed. The most common haplotype PON*1 was found to be associated with significantly lower PON1 mRNA and protein expression, as well as, significantly lower hydrolysis of atorvastatin-lactone. PON1 promoter polymorphisms -108 T>C, -832 G>A, -1741 G>A and a tightly linked group of PON3 polymorphisms (-4984 A>G, -4105 G>A, -1091 A>G, -746 C>T and F21; rs13226149) were associated with these changes.

It was analyzed with cooperation partners whether the identified variability in UGT1A3 and the PON-locus, which in vitro significantly changed atorvastatin-lactone levels, also changed the in vivo risk for adverse events or the response to atorvastatin-treatment in a large patient cohort. Samples from 1180 diabetes patients on dialysis from “Die deutsche Diabetes Dialyse Studie”, which had been either treated with atorvastatin or placebo, were retrospectively genotyped for selected marker polymorphisms (UGT1A3, PON-locus, ABCG2, CYP3A4, CYP3A5). None of the analyzed polymorphisms showed significant differences between carriers and non-carriers on the study endpoint or on lipid levels of this patient cohort. An interesting observation was the significantly decreased number of endpoints in UGT1A3*2 homozygotes in the atorvastatin and in the placebo receiving group. This might be explained by high linkage of this variant with UGT1A1*28, resulting in decreased UGT1A1 expression leading to significantly increased plasma levels of the potent antioxidant bilirubin and in this way, possibly, to significantly prolonged survival of this group, as previously described.

In summary, this work characterized genotype-phenotype associations at the UGT1A3 and the PON1/PON3-loci in a large human liver-bank. In vitro, the UGT1A3*2 haplotype and several PON-locus polymorphisms were identified as factors associated with significantly increased levels of atorvastatin-lactone, a metabolite, which has been associated with toxicity. In vivo, the UGT1A3*2 allele was associated with a significantly higher atorvastatin-lactone to -acid AUC in a study with healthy volunteers, but none of the analyzed variants had a significant atorvastatin-dependent effect on survival or lipid levels in a study with diabetes patients on dialysis.

Erhöhte LDL-Cholesterinwerte sind eindeutig mit einem gesteigerten Risiko für Arteriosklerose und koronare Herzerkrankungen assoziiert. Atorvastatin ist ein potenter HMG-CoA Reduktase Inhibitor, der den LDL-Cholesterinwert und damit das Risiko für koronare Herzerkrankungen effektiv senken kann. Obwohl Statine generell gut vertragen werden, sind unerwünschte Arzneimittelwirkungen wie Myopathie, Rhabdomyolyse und Hepatotoxizität gut belegt. Neue Erkenntnisse deuten auf eine mögliche Rolle bestimmter Atorvastatin-Metabolite bei der Entstehung von Myopathien hin. Beispielsweise zeigten Patienten, die unter Atorvastatin-Behandlung an Myopathie litten, erhöhte Plasmawerte des pharmakologisch inaktiven Metaboliten Atorvastatin-Lakton.

Ziel dieser Arbeit war es, den Metabolismus von Atorvastatin unter besonderer Berücksichtigung von Atorvastatin-Lakton zu untersuchen. Erste Untersuchungen mit 9 rekombinant erzeugten Isoformen von UDP-Glukuronosyltransferasen der Gruppen 1A und 2B und kinetische Daten von rekominantem UGT1A1 und UGT1A3 deuteten auf eine wichtige Rolle der letztgenannten Enzyme bei der Laktonisierung von Atorvastatin hin. Korrelationsanalysen der UGT1A1 und UGT1A3 Protein- und mRNA-Expression mit ebenfalls analysierter Bildung von Atorvastatin-Lakton in humanen Lebermikrosomen identifizierten eindeutig UGT1A3 als wichtigstes Enzym zur individuell variablen Bildung von Atorvastatin-Lakton. Daher wurde im UGT1A3-Gen nach Polymorphismen gesucht, die die Bildung von Atorvastatin-Lakton signifikant beeinflussen und möglicherweise die beobachtete Variabilität erklären. In der Tat konnte das UGT1A3*2 Allel mit einer signifikant erhöhten Expression von UGT1A3 mRNA und Protein als auch mit einer signifikant erhöhten Bildung von Atorvastatin-Lakton in vitro und in vivo in Zusammenhang gebracht werden. In vivo zeigte sich in UGT1A3*2 Trägern ein signifikant höheres AUC-Verhältnis von Atorvastatin-Lakton zur Säure.

Im nächsten Schritt lag der Fokus der Untersuchung auf Seite der Hydrolyse von Atorvastatin-Lakton, einer Reaktion, die die Konzentration dieses Metaboliten ebenfalls beeinflussen sollte. Durch Korrelationsanalysen der mRNA- und Proteinmengen mit Daten zur Hydrolyse konnten PON1 und PON3 als verantwortliche Enzyme dieser Reaktion identifiziert werden. Die anschließende intensive Genotypisierung des PON-Locus ermöglichte Assoziationsstudien mit den Werten zur Hydrolyse von Atorvastatin-lakton. Somit war es möglich zu zeigen, dass der Haplotyp PON*1 mit signifikant niedrigerer PON1 mRNA- und Proteinexpression als auch mit signifikant niedrigerer Hydrolyse von Atorvastatin-Lakton assoziiert ist. Insbesondere wurde nachgewiesen, dass Polymorphismen im Promotor von PON1 (-108 T>C, -832 G>A, -1741 G>A) sowie eine stark genetisch gekoppelte Gruppe von PON3 Polymorphismen (-4984 A>G, -4105 G>A, -1091 A>G, -746 C>T and F21; rs13226149) mit diesen beobachteten Unterschieden in Verbindung stehen.

Schließlich wurde in dieser Arbeit auch untersucht, ob die gefundene genetische Variabilität in UGT1A3 und im PON-Locus, die in vitro signifikant die Bildung beziehungsweise Hydrolyse von Atorvastatin-Lakton beeinflusst hatte, auch in vivo das Risiko von unerwünschten Arzneimittelwirkungen oder das Ansprechen auf eine Therapie mit Atorvastatin verändert. Zu diesem Zweck wurden in einem Kooperationsprojekt 1180 Proben von Patienten der „Deutschen Diabetes Dialyse Studie“ retrospektiv auf ausgewählte Polymorphismen (UGT1A3, PON-Locus, ABCG2, CYP3A4, CYP3A5) genotypisiert, die mit Atorvastatin oder Placebo behandelt worden waren. Die untersuchten Polymorphismen zeigten, abhängig von der Atorvastatin-Therapie, keine signifikanten Unterschiede zwischen Trägern und Nicht-Trägern bezüglich des Studienendpunktes oder der Lipid-Spiegel. Interessant war jedoch, dass signifikant weniger Endpunkte in UGT1A3*2 Homozygoten beider Gruppen auftraten. Eine Erklärung hierfür könnte die starke genetische Kopplung dieser Polymorphismen mit der UGT1A1*28 Variante sein. Diese führt zu niedrigerer UGT1A1 Expression, somit zum beobachteten signifikant erhöhten Spiegel des potenten Antioxidans Bilirubin und damit wohl zu einer signifikant gesteigerten Überlebensrate in dieser Patientenpopulation.

Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass genetische Varianten in UGT1A3 und im PON-Locus die Entstehung beziehungsweise Hydrolyse von Atorvastatin-Lakton, einem möglicherweise toxischeren Metaboliten, in vitro signifikant beeinflussen. In vivo war UGT1A3*2 in der Tat mit einem signifikant höheren Atorvastatin-Lakton zu -Säure AUC Verhältnis in gesunden Probanden assoziiert, die eine Atorvastatin Einzeldosis erhalten hatten. Keine der untersuchten Varianten zeigte jedoch in einer Studie mit Diabetes-Patienten auf Dialysebehandlung einen signifikanten, Atorvastatin-abhängigen Effekt auf das Auftreten von Studien-Endpunkten oder von Lipid-Plasmaspiegeln.