Membrane androgen receptor activation triggers pro-apoptotic responses in vitro and in vivo and blocks migration in colon cancer

Abstract

The classical intracellular androgen receptors (iAR) mediate genomic androgen signals, which take at least more than half an hour. However, the rapid or non-genomic action of androgens takes only seconds to few minutes and involves the activation of androgen membrane binding sites. Although the molecular identity of those membrane binding sites remains still unknown, their expression has been reported in many cell types, including various tumor cells. Activation of membrane androgen receptors (mAR) in prostate and breast cancer cells has been implicated in the regulation of cell growth, motility and apoptosis. Here we analyzed mAR expression and function in colon cancer. Using fluorescent mAR ligands we showed specific membrane staining in mouse colon tumor tissues and in iAR silenced Caco2 cell lines. Stimulation of colon-mAR by testosterone-albumin-conjugates induced rapid actin and tubulin cytoskeleton reorganization and generated apoptotic responses, even in the presence of anti-androgens. We showed that long-term activation of mAR in Caco2 cell lines down-regulated the activity of PI-3K and Akt and induced de-phosphorylation/activation of the pro-apoptotic Bad. Treatment of APCmin/+ mice significantly decreased the expression of p-AKT and p-Bad levels in tumor tissue. Moreover, mAR activation resulted in a 65% reduction of tumor incidence in chemically induced Balb/c mice colon tumors and an 80% reduction of tumor incidence in APCmin/+ mice colon tumors. Furthermore, mAR activation strongly inhibited Caco2 cell migration. In accordance with this, vinculin, a protein controlling cell adhesion and actin reorganization, was effectively phosphorylated upon mAR activation. Phosphorylation inhibitors genistein and PP2 inhibited actin reorganization and restored motility. Moreover, blocking actin reorganization by cytochalasin B and silencing vinculin by appropriate siRNA’s restored the migration potential. From these results we conclude that mAR activation inhibits the pro-survival signals Akt/Bad in vitro and in vivo, induces potent proapoptoric responses and blocks migration of colon cancer cells via regulation of vinculin signaling and actin reorganization. Our results point to a central role of mAR in the induction of anti-tumor responses in colon cancer.

Die klassischen intrazellulären Androgenrezeptoren (iAR) vermitteln die genomische Androgenwirkung, die wenigstens 30 Minuten Zeit erfordert. Im Gegensatz hierzu benötigen die schnellen, nichtgenomischen Androgeneffekte nur einige Sekunden bis wenige Minuten durch die Aktivierung von Androgenbindungsstellen in der Zellmembran. Derartige membranständige Androgenbindungsstellen wurden schon in vielen Zelltypen inklusive Tumorzellen nachgewiesen, obwohl die molekulare Identität dieser Bindungsstellen noch immer unbekannt ist. Die Aktivierung dieser membranständigen Androgenrezeptoren (mAR) steht im Zusammenhang mit der Regulation von Zellwachstum, Motilität und Apoptose. Mit der vorliegenden Arbeit wurde die Expression und Funktion von mAR bei Kolonkarzinomen untersucht. Mithilfe fluoreszierender mAR-Liganden konnten membranständige Rezeptoren spezifisch angefärbt werden in Kolonkarzinomgewebe der Maus und in Caco2-Zellen, die nicht über iAR verfügen. Die Stimulierung von mAR in Dickdarmgewebe durch Testosteron-Albumin-Konjugate führte zu einer raschen Reorganisation des Aktin- und Tubulinnetzwerkes und löste Apoptose selbst in Anwesenheit von Antiandrogenen aus. Die längeranhaltende Aktivierung von mAR in Caco2-Zellen führte zu verminderter PI-3- und Akt-Kinaseaktivität und zur Dephosphorylierung und mithin Aktivierung von proapoptotischem Bad. Eine entsprechende Behandlung von APCmin/+-Mäusen verringerte die Expression von p-Akt und von p-Bad signifikant in Tumorgewebe. Darüber hinaus führte die Aktivierung von mAR zu einer Verminderung der Tumorinzidenz um 65% bei chemisch induzierten Dickdarmtumoren von Balb/c-Mäusen und um 80% bei APCmin/+-Mäusen. Weiterhin hemmte die mAR-Aktivierung die Zellmigration von Caco2-Zellen stark. In Übereinstimmung mit diesem Befund war Vinculin, ein Protein, das Zelladhäsion und Aktinreorganisation reguliert, nach mAR-Aktivierung deutlich phosphoryliert. Die Phosphorylierungsinhibitoren Genistein und PP2 hemmten die Aktinreorganisation und reaktivierten die Zellmotilität. Zusätzlich konnte die Blockade der Aktinreorganisation durch Cytochalasin B oder die auf siRNA basierende Herunterregulation von Vinculin das Migrationspotential der Zellen wiederherstellen. Aus diesen Daten kanngeschlossen werden, dass die Aktivierung von mAR die überlebensfördernden Akt/Bad-Signale in vitro und in vivo hemmt, wirkungsvolle proapoptotische Zellantworten induziert und die Migration von Kolontumorzellen über die Regulierung des Vinculin-Signalweges und der Aktinreorganisation blockiert. Diese Erkenntnisse deuten auf eine zentrale Rolle von mAR für die Induktion von Antitumorantworten bei Kolonkarzinom.