Ultrastructural characterisation of melanogenesis in adult human retinal pigment epithelial cells after adenoviral transduction with the tyrosinase gene

Abstract

Until recently, it was widely accepted that melanogenesis does not occur in the adult retinal pigment epithelium (RPE), since the typical hallmarks of melanogenesis, the premelanosome and the expression of melanogenic proteins like tyrosinase and melanocyte-associated protein 17 (PMEL17), were absent post-natal. In the meantime, active tyrosinase has been observed in the adult RPE of different animal species, e.g. after phagocytosis of retinal photoreceptor outer segments (ROS). The aim of this thesis was to investigate whether melanogenesis can be induced in adult human RPE cells in response to ROS phagocytosis or after transduction with a tyrosinase vector. The role of the melanogenic proteins PMEL17 and TRP1 and the classical melanosomal stages, known from pre-natal melanin synthesis, were also to determine. As a model system tyrosinase transduced amelanotic RPE cells were used to study tyrosinase function and melanogenesis and the influence of phagocytosis in adult RPE. The presences of the melanogenic proteins tyrosinase, tyrosinase-related protein 1 (TRP1) and PMEL17 were investigated using immunocytochemistry. Tyrosinase activity and loclisation was further studied with electron microscopical DOPA histochemistry. The ultrastructural morphology of melanogenic stages was compared to that of pigmented melanoma cells (MNT-1), which were used as a positive control for typical melanogenesis. Melanin synthesis was detected with HPLC analysis. MTT tests confirmed that viability was not affected after tyrosinase transduction and melanin synthesis. Post-natal RPE melanogenesis was also studied in animal experiments after subretinal injection of the tyrosinase vector in rats and rabbits. Compared to controls, tyrosinase active cells had a redifferentiated cobblestone morphology, were pigmented and had an improved phagocytosis rate. Tyrosinase trafficking was different to the classical model found in MNT-1 cells, since a DOPA reaction was not observed in Golgi-derived vesicles, but as membrane-less, small DOPA granules free-floating in the cytoplasm. Melanogenesis occurred without the involvement of TRP1, PMEL17 and typical striated premelanosomes and melanogenic stages. In contrast, melanin was synthesised in lysosome-like organelles. Thus, a new pathway of melanogenesis is described for this model system. Transduced RPE cells of living rats and rabbits and cultured cells of human donors showed also a similar morphology of melanogenesis as the ARPE-19 cells. Interestingly, control MNT-1 cells contained similar melanosomes in addition to the classical stages of melanogenesis. Although a transport of ingested material to newly-formed ARPE-19 melanosomes was not observed, phagocytosis led to an improved tyrosinase activity and to an accelerated melanogenesis, compared to non-fed transduced cells. In conclusion, tyrosinase transduction in combination with phagocytosis led to a morphological reorganisation and functional improvement of cultured ARPE-19 cells. Additionally, melanogenesis has been induced, which is independent of premelanosome formation. It can be transferred to the in vivo situation by gene therapy.

Bis vor kurzem war es allgemein akzeptiert, dass die Melansomen des retinalen Pigmentepithel (RPE) nur pränatal gebildet werden und danach nicht erneuert werden können. Typische Merkmale der Melanogenese, wie die Bildung von Prämelanosomen und melanogenetischen Proteinen (Tyrosinase, Melanozyten-assoziiertes Protein 17 (PMEL17)), waren adult nicht auffindbar. Zwischenzeitlich konnte allerdings das aktive Enzym Tyrosinase im adulten RPE verschiedener Spezies nachgewiesen werden, z.B. nach Phagozytose von retinalen Stäbchenaußensegmenten (ROS). Die Fragestellung dieser Doktorarbeit was es herauszufinden, ob eine Neusynthese des Melanins in adulten humanen RPE-Zellen induziert werden kann, indem sie mit ROS gefüttert werden oder mittels eines adenoviralen Vektors eine Tyrosinase-Überexpression induziert wird. Außerdem sollte die Rolle der melanogenetischen Proteine PMEL17 und Tyrosinase-assoziiertes Protein 1 (TRP1) und der typischen Melanogenesestadien I-IV, wie sie aus der pränatalen Melaninsynthese bekannt sind, evaluiert werden. Die Experimente wurden an tyrosinase-transduzierten amelanotischen RPE-Kulturen (ARPE-19-Zellline) durchgeführt. Diese Zellen dienten als Modellsystem zur Untersuchung der Funktion der Tyrosinase, der Melanogenese und des Einflusses der Fütterung auf das adulte RPE. Das Vorhandensein der melanogenetischen Proteine Tyrosinase, TRP1 und PMEL17 wurde immunhistologisch geprüft. Die Aktivität und die Lokalisierung der Tyrosinase in der Zelle wurden mittels DOPA-Histologie im Elektronenmikroskop untersucht. Die Ultrastruktur der auftretenden Stadien der Melanogenese¬ wurde mit der von pigmentierten Melanomzellen (MNT-1) verglichen. MNT-1 Zellen dienten ebenfalls als Positivkontrollen für die histo-logischen Färbungen. Die Neusynthese des Melanins wurde durch HPLC-Analysen bestätigt. MTT-Tests zeigten, dass die Viabilität der tyrosinase-transduzierten Zellen gegenüber Kontrollzellen auch nach der Melanisierung nicht beeinträchtigt war. Desweiteren wurde die postnatale Melanogenese des RPE nach subretinaler Injektion des Vektors in Albino-Ratten und Kaninchen untersucht. Verglichen mit den nicht-transduzierten ARPE-19 Zellen zeigten die tyrosinase-transduzierten ARPE-19 Zellen eine redifferenzierte epithelartige Morphologie, waren tyrosinase-positiv und pigmentiert und zeigten außerdem eine stärkere Phagozytose. Verglichen mit den MNT-1 Melanomzellen, welche als Positivkontrolle für eine typische Melanogenese dienten, zeigten die tyrosinase-transduzierten ARPE-19-Zellen einen stark veränderten Tyrosinasetransport und eine andersartige Morphologie der melanosomalen Vorstufen. Golgi-Apparate und deren Transportvesikel waren wider Erwarten tyrosinasefrei, statt dessen zeigte sich eine positive DOPA-Reaktion in nicht-membranumhüllten, kleinen Granula im Zytoplasma. TRP1 und PMEL17, Prämelanosomen und typische Melanogenese¬stadien wurden nicht gefunden. Statt dessen wurde das Melanin in lysosomenartigen Organellen synthetisiert und gespeichert. Interessanterweise zeigten selbst die MNT-1 Zellen neben den klassischen Melanogenesestadien auch eine Melaninsynthese in lysosomen¬artigen Organellen. Anhand dieser Daten konnte ich einen neuen Verlauf der Melanin¬synthese beschreiben. Transduzierte RPE Zellen von lebenden Ratten und Kaninchen und auch kultivierte und transduzierte Spender-RPE Zellen zeigten eine ähnliche Melanogenese wie die transduzierten ARPE-19 Zellen. Obwohl der Transport von phagozytiertem Material in neu gebildete Melanosomen für die ARPE-19-Zellen hier nicht einwandfrei nachgewiesen wurde, konnte doch gezeigt werden, dass eine Phagozytose zu einer verstärkten Tyrosinaseaktivität und zu einer schnelleren Melaninsynthese gegenüber den ungefütterten transduzierten Zellen führte. Fazit: Tyrosinase-Transduktion in Kombination mit Fütterung von retinalen Stäbchen-außensegmenten führt zu einer morphologischen Reorganisation und zu einer Verbesserung der Zellfunktion in ARPE-19-Zellen. Die Melanin-Neusynthese hier ist unabhängig von der Bildung von typischen Prämelanosomen. Die gefunden Ergebnisse lassen sich mittels Gentherapie auch in die in vivo-Situation übertragen.