Untersuchungen zur Bedeutung des glattmuskel-spezifischen BK(Ca)-Kanals für die Ätiologie von Reizblase und Atemwegs-Obstruktion mit Hilfe konstitutiver sowie konditionaler BK-Knockout-Mausmodelle

Abstract

Der durch hohe K+-Leitfähigkeit charakterisierte spannungs- und Ca2+-abhängige BK-Kanal besitzt eine bedeutende Funktion für die Regulation des Membranpotentials. Sein hyperpolarisierender K+-Ausstrom antagonisiert Membran-Depolarisationen sowie den über spannungsabhängige Ca2+-Kanäle vermittelten Anstieg der intrazellulären Ca2+-Ionen Konzentration und beeinflusst hierdurch die Kontraktilität glatter Muskelzellen. Eine konstitutive Deletion des BK-Kanals in Mäusen (BK-/-) führte zur Entstehung einer überaktiven Harnblase mit verstärkter Kontraktilität des Detrusormuskels sowie erhöhter Miktions-Frequenz. Jedoch imponierte dieser beobachtete Phänotyp nach induzierbarer, glattmuskel-spezifischer Deletion des BK-Kanals (SM-BK-/-) mit einer deutlich schwerwiegenderen Ausprägung. Dieses Phänomen ließ den Einfluss kompensatorisch aktiver Signalwege in BK-/- Harnblasen vermuten, welche zu einer signifikanten Reduktion der Übererregbarkeit des Detrusormuskels beitragen können. So war in konstitutiven BK-/- Harnblasen im Vergleich zu Kontrollen eine verstärkte Expression der Proteinkinase-A (PKA) detektierbar, die in induzierbaren SM-BK-/- Mäusen zum Untersuchungszeitpunkt nicht vorlag. Die Hochregulation der PKA zeigte sich assoziiert mit einer gesteigerten beta-Adrenozeptor- bzw. cAMP-vermittelten Hemmung von Detrusormuskel-Kontraktionen in BK-/- Mäusen im Vergleich zu deren Kontrollen. Diese Erscheinung war in induzierten SM-BK-/- Harnblasen um 60-70% verringert. Mit Hilfe des spezifischen PKA-Antagonisten Rp-cAMPS konnte der cAMP-Signalweg im BK-/- Detrusor nur unvollständig blockiert werden, während in Wildtyp-Kontrollen (WT) eine, im Verhältnis zur jeweiligen Gesamtrelaxation, umfassendere Hemmung möglich war. Diese Befunde deuten auf zusätzliche PKA-unabhängige und kompensatorisch aktive cAMP-Effektoren in der Harnblase von BK-/- Mäusen hin. So führte das cyclische Nukleotid 8-pCPT-2’-O-Me-cAMP, ein spezifischer Aktivator des cAMP-Effektor-Proteins Epac, wiederum zu verstärkter Kontraktionshemmung im BK-/- Detrusor. Hierbei konnte durch Zuhilfenahme eines Epac2-Antikörpers in Harnblasen von BK-/- Mäusen die Hochregulation einer möglicherweise neuen Epac2-Spleißvariante ermittelt werden. Darüber hinaus lieferten die Ergebnisse einer Proteom-Analyse weiteren Aufschluss über additiv regulierte Proteine zur kompensatorischen Abschwächung des Reizblasen-Phänotyps in BK-/- Mäusen. Hingegen erwies sich der BK-Kanal in glatten Atemwegs-Muskelzellen für die Kontrolle einer Methacholin-provozierten Abnahme der in vivo gemessenen, mittleren exspiratorischen Atemstromstärke (MEF50) als unbedeutend. Die Abnahme ließ hierbei in SM-BK-/- Mäusen innerhalb des physiologischen Gesamtkontextes keinen Unterschied zu Kontrollen erkennen, obwohl „kompensatorische“ Veränderungen, wie sie ebenfalls im Respirationstrakt von BK-/- Mäusen infolge ubiquitären Knockouts beobachtet werden konnten, fehlten. Anhand konstitutiver sowie induzierbarer BK-Kanal-Deletion waren in dieser Arbeit somit gewebespezifische BK-Kanal-Effekte sowie Kompensationsmechanismen identifizierbar, die zumindest in der murinen Harnblase einen relevanten Beitrag zur Relaxation und Abschwächung des beobachteten Phänotyps leisten und neben dem BK-Kanal potentiell interessante Angriffspunkte zur Therapie eines Reizblasensyndroms darstellen könnten.

The large-conductance, voltage- and Ca2+-dependent K+ (BK) channel plays a pivotal role in the regulation of membrane potential. Its hyperpolarizing K+ outward current antagonizes both membrane depolarization and the subsequent increase in intracellular Ca2+-concentration mediated by voltage-dependent Ca2+ channels, thereby controlling smooth muscle contractility. Constitutive deletion of BK channel in mice (BK-/-) resulted in an overactive bladder associated with increased contractility of detrusor muscle and frequent micturition. However, this observed phenotype was more severely pronounced after inducible and smooth muscle-specific deletion of BK channel (SM-BK-/-). Due to this fact, compensatory and functionally active signaling pathways were assumed in BK-/- bladder, leading to a significant reduction in detrusor muscle overactivity. We found increased expression of cAMP-kinase (protein kinase A; PKA) in urinary bladder of BK-/- but not SM-BK-/- mice when compared to their controls. Upregulation of PKA in BK-/- mice was accompanied by enhanced beta-adrenoceptor/cAMP-mediated suppression of detrusor contractions by isoproterenol. This effect was attenuated by about 60-70% in SM-BK-/- mice. By means of Rp-cAMPS, a specific PKA-inhibitor, the enhanced cAMP-signaling in BK-/- detrusor muscle could only partially be blocked, whereas, in relation to overall relaxation, a more pronounced inhibition was observed in wildtype-controls (WT). These results pointed to additional PKA-independent and compensatory active cAMP-effectors in urinary bladder of BK-/- mice. Therefore again, the cyclic nucleotide 8-pCPT-2’-O-Me-cAMP which is a specific activator of cAMP-stimulated Epac, induced stronger suppression of contractions in BK-/- detrusor. Using specific Epac2-antibodies, the upregulation of a potential new Epac2-splicevariant in BK-/- urinary bladder could be identified. Furthermore, proteome analysis of BK-/- bladder tissue revealed additionally regulated proteins for compensatory reduction of the overactive urinary bladder phenotype in BK-/- mice. However, in airway smooth muscle cells, BK channel turned out to be of minor significance with regard to the control of Methacholine-induced decrease in mid-expiratory airflow (MEF50) in vivo. The decline of MEF50-values displayed no difference between SM-BK-/- and control mice despite the lack of “compensatory” changes in protein expression as seen in airway smooth muscle of constitutive BK-/- mice. On the basis of a constitutive as well as inducible BK channel deletion, a number of smooth muscle-specific effects of BK channel and compensatory mechanisms could be identified, contributing essentially to relaxation and reduction of the analyzed phenotype in murine urinary bladder. In conclusion, both BK channel and the observed compensatory mechanisms might represent potential interesting targets for future treatment of overactive urinary bladder.