Auswirkungen einer Immuntherapie auf die Angiogenese in Tumoren und Psoriasis

Abstract

The aim of this dissertation was to investigate the effects of immune therapies on angiogenesis in two different diseases, tumours and psoriasis. The objectives in the tumour project were to establish a protective, tumour-antigen specific T helper (Th)-1 cell therapy and investigate the underlying cytokine-mediated, antiangiogenic mechanism, and the possible involvement of the host environment. Therefore, we generated non-transgenic epithelial cell adhesion molecule (EpCAM)-reactive Th1 cells in vivo, expanded, and characterised them in vitro. We confirmed their therapeutical efficiency in a subcutaneous tumour model using EpCAM transfected CT26 carcinoma cells and reached up to 84% reduction of tumour weight by day 18 after tumour cell injection. We found significant changes in the expression patterns of interferon (IFN)-gamma, interleukin (IL)-12/p35, IL-23/p19, IL-27/Ebi3, IL-6, and IL-17, peaking at the initiation of tumour growth inhibition on day 13 after tumour cell injection. Accordingly, electron microscopy of tumours revealed endothelial cell death and vessel obliteration suggesting that tumour vessels in Th1 cell treated mice were severly impaired. Moreover, enhanced diapedesis was observed as sign of inflammation. FACS analysis of cells infiltrating the tumour suggests that CD4+ and CD11b+ cells are involved in mediating the therapeutic effects. The aim of the second project was to investigate the effects of dimetylfumarate (DMF), an antipsoriatic compound, on angiogenesis in vitro and in vivo, and identify possible underlying signal transduction pathways. We found that DMF influenced the intracellular redox system by increasing intracellular reactive oxygen species (ROS) levels. Increases in ROS resulted in the inhibition of endothelial cell (EC) function. In vitro, we found that DMF significantly reduced endothelial cell growth supplement/ vascular endothelial growth factor (ECGS/VEGF) induced proliferation, migration, and sprout formation of EC in a dose dependent manner without significantly increasing EC apoptosis or cell cycle arrest. The application of antioxidants such as N-acetylcysteine or glutathione together with DMF completely restored EC proliferation and sprouting after DMF treatment, showing that ROS were central mediators of DMF induced antiangiogenesis. Furthermore, analysing underlying signal transduction pathways in vitro, we were unable to show significant effects on mTOR, ERK1/2, and p38 phosphorylation. In vivo, DMF significantly reduced neovascularization in the chorioallantoic membrane assay, directly proving the in vivo relevance of the in vitro findings.

Ziel dieser Doktorarbeit war es, die Auswirkungen von Immuntherapien auf die Angiogenese zu untersuchen. Im ersten Teil wurden Mechanismen der Tumorantigen-spezifischen Th1 Zelltherapie untersucht. Es wurde der Einfluss von Zytokinen auf die Angiogenese und die Wirtsumgebung des Tumors analysiert. Dazu wurden in vivo EpCAM-reaktive T-Helferzellen (Th)1 Zellen generiert, in vitro expandiert und charakterisiert. Ihr therapeutisches Potential konnte mit Hilfe einer subkutan injizierten EpCAM-exprimierenden CT26 Karzinomzelllinie gezeigt werden. Wir erzielten eine bis zu 84% Reduktion des Tumorgewichts durch die T-Zell Therapie. Es wurden signifikante Unterschiede im Expressionsmuster von Interferon (IFN)-gamma, Interleukin (IL)-12/p35, IL-23/p19, IL-27/Ebi3, IL-6 und IL-17 festgestellt, die an Tag 13 nach der Tumorzellinjektion ihren Höhepunkt erreichten. Dies korrelierte mit der Initiation der Tumorwachstumsinhibition. Die Elektronenmikroskopie zeigte Nekrose von Endothelzellen und Gefäßobliterationen auf. Dies lässt darauf schließen, dass die Tumorgefäße durch die Therapie stark geschädigt wurden. Auch wurde eine verstärkte Diapedese nachgewiesen. Die FACS-Analyse der infiltrierenden Zellen ergab, dass CD4+ und CD11b+ Zellen an der Therapie beteiligt sind. Im zweiten Projekt wurde der Einfluss des Immunmodulators Dimethylfumarat (DMF) auf die Angiogenese in vitro und in vivo untersucht, einschließlich möglicher Signalwege. DMF erhöhte das intrazelluläre ROS (reaktive Sauerstoffspezies) Level. Dies führte zu einer Inhibition zahlreicher Endothelzellfunktionen. In vitro, führte die ROS Induktion zu einer signifikanten Inhibition der ECGS/VEGF (endothelial cell growth supplement/vascular endothelial growth factor) induzierten Proliferation, Migration und der Aussprossung von Endothelzellen, ohne die Apoptoserate oder den Zellzyklus nachweisbar zu beeinflussen. Antioxidantien wie N-Acetylcystein oder Glutathion stellten die Proliferation und Aussprossung wieder her. Dies zeigt, dass erhöhte ROS Spiegel in vitro einen starken antiangiogenen Effekt besitzen. Untersuchungen der Signalkaskade führten zu keinem signifikanten Einfluss auf die Phosphorylierung von mTOR, ERK1/2 und p38. In vivo reduzierte DMF deutlich die Gefäßneubildung im Chorioallantois-Membran-Assay. Dies belegt die in vivo Relevanz der in vitro Befunde.