Molekularbiologische und biochemische Untersuchungen der Fumigaclavinbiosynthese in Aspergillus fumigatus AF 293 / B 5233 und Penicillium commune NRRL 2033

Abstract

Fumigaclavin A, B und C sind Ergotalkaloide des Clavin-Typs und werden von Aspergillus- und Penicillium-Arten produziert. Neueste Untersuchungen zeigen, dass Fumigaclavin C experimentell induzierte Leberschäden und Kolitis bei Mäusen bessern kann und gefäßrelaxierend wirkt. Fumigaclavine haben dieselbe Grundstruktur wie Lysergsäure und Dihydrolysergsäure, die Säurekomponenten der pharmazeutisch wichtigen Ergotalkaloide aus Claviceps purpurea bzw. derer semisynthetischen Derivate. Aufgrund der ähnlichen Strukturen und der gleichen biogenetischen Herkunft sind die Untersuchungen zur Biosynthese von Fumigaclavinen auch für das Verständnis der Biosynthese von Ergotalkaloiden aus C. purpurea von Bedeutung.

Ein putatives Biosynthesegencluster von Fumigaclavin C wurde in der Genomsequenz von Aspergillus fumigatus AF 293 identifiziert. Das putative Gencluster ist 22 kb groß und enthält 11 ORFs. Sequenzanalyse und Vergleich mit Datenbankeinträgen der Gene aus dem Cluster ermöglichte die Aufstellung eines hypothetischen Biosyntheseweges für Fumigaclavin C.

Der experimentelle Beweis für die Identität des Clusters von Fumigaclavin C aus A. fumigatus wurde durch heterologe Überexpression der beiden Prenyltransferasegene fgaPT1 (=Afu2g17990) und fgaPT2 (=Afu2g18040) in E. coli bzw. in Saccharomyces cerevisiae und anschließende biochemische Charakterisierung der Genprodukte erbracht. FgaPT2 katalysiert die Prenylierung von L-Tryptophan zu Dimethylallyltryptophan und somit den ersten Schritt in der Ergotalkaloid-Biosynthese. FgaPT1 katalysiert den letzten Schritt der Fumigaclavin C-Biosynthese, die reverse Prenylierung von Fumigaclavin A an Position 2 des Indolrings. Sowohl FgaPT1 als auch FgaPT2 verwenden Dimethylallyldiphosphat (DMAPP) als Prenyldonor. Die Enzyme wurden als His-tag Proteine überproduziert und mit Hilfe einer NTA-Nickel-Affinitätssäule zur Homogenität gereinigt. Die enzymatischen Produkte wurden über HPLC isoliert und deren Strukturen mittels spektroskopischer Methoden (NMR und MS) aufgeklärt. Die biochemischen Eigenschaften der beiden Enzyme, die kinetischen Parameter und die Ionenabhängigkeit wurden untersucht.

FgaPT2 und FgaPT1 sind 52,5 kDa bzw. 50,2 kDa Proteine und liegen in ihrer aktiven Form als Dimere vor. Für FgaPT2 wurden Km -Werte von 8 µM für L-Tryptophan und von 4 µM für DMAPP bestimmt. Die Km-Werte von FgaPT1 wurden für Fumigaclavin A mit 6 µM und für DMAPP mit 13 µM bestimmt. Es konnte gezeigt werden, dass die beiden Enzyme wie auch Dimethylallyltryptophansynthasen aus anderen Pilzen und FtmPT1 aus dem Biosynthesegencluster von Fumitremorginen aus A. fumigatus zu einer neuen Gruppe von Prenyltransferasen gehören, die als lösliche Enzyme vorliegen, keine divalenten Metallionen für ihre Aktivität benötigen und aromatische Substrate prenylieren. Die Dimethylallyltransferase FgaPT2 aus A. fumigatus wurde mit und ohne die beiden Substrate L-Tryptophan und DMAPP kristallisiert. Aus den Kristallen konnten Röntgenbeugungsmuster erhalten werden, die in der Zukunft die Aufklärung der Kristallstruktur erlauben könnten und somit einen wichtigen Beitrag für das Verständnis der Struktur und Funktion der pilzlichen Prenyltransferasen bedeuten würden. Bisher liegen keine Kristalldaten von pilzlichen Prenyltransferasen vor.

Die Identifizierung des Biosynthesegenclusters von Fumigaclavin C aus dem pathogenen Pilz Aspergillus fumigatus stellt eine Alternative zum Cluster aus C. purpurea für die Untersuchungen der Biosynthese von Ergotalkaloiden zur Verfügung, denn Fumigaclavin C hat nicht nur die gleiche Grundstruktur wie Lysergsäure, beide Substanzen haben dieselbe biogenetische Herkunft und teilen mehrere der ersten Reaktionsschritte in der Biosynthese.

Ein weiteres putatives Fumigaclavin-Biosynthesegencluster wurde aus Penicillium commune NRRL 2033 kloniert. Das Cluster wurde durch Screening einer Cosmidbank mit homologen PCR-Primern für ein DMATS-Genfragment identifiziert. Die homologen Primer konnten nach Sequenzierung eines mit Hilfe von degenerierten Primern für DMATS-Gene amplifizierten Fragmentes synthetisiert werden. Ein Vergleich des Clusters aus P. commune mit dem von C. purpurea und A. fumigatus zeigte, dass sich die strukturellen Unterschiede der von den drei Stämmen produzierten Ergotalkaloide erstaunlich genau in der Organisation der Cluster wiederfinden. Mit P. commune steht somit ein nichtpathogener Fumigaclavin-Produzent für die weitere Untersuchung der Ergotalkaloide zur Verfügung. Durch den Vergleich der drei Cluster konnten neue Hypothesen über die Ergotalkaloidbiosynthese und die beteiligten Enzyme und Gene für alle drei Pilze aufgestellt werden.

Fumigaclavines A, B and C are ergot alkaloids of the clavine type and are produced by species of the genera Aspergillus and Penicillium. Recent studies have shown that fumigaclavine C can improve experimentally induced liver injury and colitis in mice and has vasorelaxant properties. Fumigaclavines have structural features similar to lysergic and dihydro-lysergic acid, the acidic components of the pharmaceutically important ergot alkaloids from Claviceps purpurea and their semisynthetic derivatives. In addition to their similar structures both substances share a common biogenetic origin, therefore the molecular and biochemical investigations on the biosynthesis of the fumigaclavines are also important for the understanding of the biosynthesis of ergot alkaloids from C. purpurea.

A putative biosynthetic gene cluster of fumigaclavine C has been identified in the genomic sequence of Aspergillus fumigatus AF 293. The putative gene cluster spans 22 kb and comprises 11 ORFs. Sequence analysis and comparison of the genes from the cluster with data base entries permitted the postulation of a hypothetical biosynthetic pathway for fumigaclavine C.

Experimental evidence for the identity of the fumigaclavine C cluster from A. fumigatus was provided by heterologous overexpression of the two prenyltransferase genes fgaPT1 (=Afu2g17990) and fgaPT2 (=Afu2g18040) in E. coli and Saccharomyces cerevisiae, respectively, and biochemical characterisation of the gene products. FgaPT2 catalyzes the prenylation of L-tryptophan to give dimethylallyltryptophan and thereby the first step of ergot alkaloid biosynthesis. FgaPT1 catalyzes the last step of fumigaclavine C biosynthesis, the reverse prenylation of fumigaclavin A at position 2 of the indole ring. Both FgaPT1 and FgaPT2 use dimethylallyl diphosphate (DMAPP) as prenyl donor. The enzymes were overproduced as His-tag proteins and purified to near homogeneity with Ni-NTA-affinity chromatography. The enzymatic products were isolated by HPLC and their structures were confirmed by spectroscopic methods (NMR and MS). The biochemical properties, the kinetic parameters and the dependence of the activity on metal ions of both enzymes were investigated.

FgaPT2 and FgaPT1 are 52.5 kDa and 50.2 kDa proteins, respectively, and are active as homodimers. For FgaPT2 Km-values were determined with 8 µM for L-tryptophan and 4 µM for DMAPP. Km-values for FgaPT1 were determined as 6 µM for fumigaclavine A and 13 µM for DMAPP. Both enzymes, together with dimethylallyltryptophan synthases from other fungi and FtmPT1 from the biosynthetic gene cluster of fumitremorgins from A. fumigatus, have been shown to belong to a new group of prenyltransferases, which exist as soluble enzymes, are independent in their activity from divalent metal ions, and prenylate aromatic substrates.

The dimethylallyltransferase FgaPT2 from A. fumigatus was crystallized with and without its substrates L-tryptophan and DMAPP. X-ray diffraction patterns could be obtained from the crystals, from which the structure of FgaPT2 might be deduced in the future, thereby providing an important contribution to the understanding of the structure and function of fungal prenyltransferases, for which no crystal structure has been reported yet.

A putative biosynthetic gene cluster of fumigaclavine A was also cloned from Penicillium commune. The cluster was identified through the screening of a cosmid library with homologous PCR-primers for a DMATS gene fragment. The homologous primers were designed after the sequencing of a fragment amplified with degenerate primers for DMATS-genes. A comparison of the cluster from P. commune with those of C. purpurea and A. fumigatus showed, that the structural differences of the ergot alkaloids produced by the three species are reflected in the organisation of their clusters. P. commune represents a non-pathogenic fumigaclavine producer for further investigation of ergot alkaloids. By comparison of the three clusters, new hypotheses about the ergot alkaloid biosynthesis and the roles of the responsible enzymes could be deduced for all three fungi.