Quantitative Analyse von T-Zell Stimulation und Costimulation durch zelluläre Mikrosysteme

Abstract

Die Aktivierung der T-Zellen des Immunsystems erfolgt durch Interaktionen der T-Zell-Rezeptoren (TCR) mit spezifischen Komplexen aus MHC-Molekülen und antigenen Peptiden auf Ziel-Zellen, wodurch eine Kaskade von durch Kinasen vermittelten Protein-Phosphorylierungen ausgelöst wird. Die entstehenden Phospho-Tyrosin-Motive fungieren in der Rekrutierung und Aktivierung weiterer Enzyme. Ein Beispiel hierfür ist ist die Phosphorylierung des TCR/CD3-Komplex durch die Kinase LCK, gefolgt von der Rekrutierung der ZAP-70 Kinase. Im Zusammenspiel des TCR mit Costimuli wie z.B. CD28 werden zelluläre Antworten wie Genexpression und zum Kontakt-stabilisierenden Rearrangement des Zytoskeletts ausgelöst. Wegen der Bedeutung extrazellulärer Stimuli für die Immunantwort besteht ein großes Interesse an der Entwicklung analytischer Techniken, die die quantitative Analyse zellulärer Interaktionen und unterliegender molekularer Prozesse ermöglichen und so die Integration dieser Ereignisse in Signal-Netzwerke ermöglichen. Da die an der T-Zell-Aktivierung beteiligten Komponenten weitgehend bekannt sind, ist der nächste Schritt, die zur Aktivierung der T-Zelle führenden Ereignisse unter Berücksichtigung zeitlicher Abläufe und Stimulus-Intensitäten zu analysieren. Im ersten Teil dieser Arbeit wurden die Signalwege der T-Zell-Aktivierung auf der morphologischen Ebene untersucht. Zum Einen wurde die Empfindlichkeit eines Kontakts und zwischen einer T-Zelle und einer mit anti-CD3-Antikörpern beschichteten Oberfläche gegenüber einem zu unterschiedlichen Zeitpunkten zugegebenen LCK-Inhibitor untersucht. Weiterhin wurde der Einfluss von Inhibitoren verschiedener Signalproteine auf die Zell-Anheftung und Aktivierung des Transkriptionsfaktors NFAT von mit anti-CD3 und anti-CD28 in unterschiedlichen Kombinationen stimulierten Zellen in einem zellulären Mikroarray quantifiziert. Weiterhin dienten mikrostrukturierte Oberflächen zur Analyse der Einflüsse lokaler Stimulation auf die Rekrutierung von Signalproteinen. Auf der biochemischen Ebene wurde mit Hilfe von aus Protein-Protein Interaktionsmotiven abgeleiteten Peptidmikroarrays die stimulationsabhängige Ausbildung von Multiprotein-Komplexen analysiert.

The activation of T cells in the immune system occurs via interactions of the T cell-receptors (TCR) with specfic complexes formed by MHC molecules and antigenic peptides on the surface of target cells, initiating a cascade of kinase-mediated protein phosphorylations. The resulting phosphotyrosine motifs enable the recruitment and activation of further enzymes.One example for this is the phosphorylation of the TCR/CD3-complex by the LCK kinase, followed by the recruitment of the ZAP-70 kinase. In concert of the TCR with costimuli such as CD28, cellular responses such as gene expression and contact-stabilizing rearrangements of the cytoskeleton are initiated. Because of the importance of extracellular stimuli for the immune response there is a great interest in the development of analytical techniques enabling the quantitative analysis of cellular interactions and the underlying molecular processes and thus the integration of these events into signalling networks. Since the components involved in T cell activation are widely known, the next step would be the analysis of these events considering time dependence and signal intensities. In the first part of this thesis, T cell signalling pathways were analyzed on the morphological scale. Firstly, the sensitivity of a contact between a T cell and an anti-CD3 functionalized surface to an LCK inhibitor was analyzed at different time points. In the next step, the influence of inhibitors of different signalling proteins on cell adhesion and the activation of the transcription factor NFAT induced by stimulation was quantified in a microarray, in which cells were stimulated by different immobilization concentrations of anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. Moreover, microstructured surfaces were employed to analyze the influence of local stimulation on the recruitment of signalling proteins. On the biological scale, peptide microarrays derived from protein-protein interaction motifs were used to analyze the stimulation-dependent formation of multiprotein complexes.