Structure function and properties of copper-containing proteins: hemocyanins and superoxide dismutase

Abstract

The purpose of this thesis was to study the structure and properties of the metal - containing proteins, hemocyanins and superoxide dismutase. Both proteins contain copper ions in their active site and are useful in immunotherapy of various diseases. 1. The oligomeric stability of gastropodan hemocyanins Rapana venosa (RvH) and Helix vulgaris and their structural subunits RvH1 and RvH2 has been investigated. The reassociation of these two RvH isoforms and the native molecule was characterized in buffers with different pH values and concentrations of Ca2+ and Mg2+ chloride. Mixed RvH subunits reassociate into didecamers and multidecamers over a period of 2 days of dialysis using a stabilizing buffer (SB). RvH1 and RvH2 are biochemically and immunologically different and have also different dissociation properties. The reassociation, performed at pH 9.6 with 2 mM CaCl2 and MgCl2 over a period of several weeks, led to the formation of decameric oligomers, while didecamers formed predominately in the stabilizing buffer (SB) at pH 7.0. Higher concentrations of calcium and magnesium ions led to a more rapid reassociation of RvH1 resulting in long stable multidecamers and helical tubules. The reassociation of the RvH2 structural subunit in the same buffers processed slowly and yielded didecamers, shorter tubule polymers and long multidecamers which are less stable at higher pH values. 2. Using Zn2+ ions as new method, several FUs have been isolated from molluscan Hc Rapana venosa without formation of non-functional proteolytic side products. N-terminal sequences of these fragments in comparison with FUs from other gastropodan Hcs show a very high degree of structural identity. Only four FUs, purified from enzyme-treated structural subunits RvH1 and RvH2 show identical N-terminal sequences compared to fragments isolated after treatment with Zn2+ ions. 3. Two isoforms alpha-hemocyanin and beta-hemocyanin of the garden snail Helix vulgaris have been isolated from the hemocyanin which do not reassociate completely in 50 mM CaCl2 and MgCl2 buffer, pH 7.0 4. It is generally accepted that the sugar constituents of the hemocyanin are likely to be implicated in their antigenicity. Carbohydrate moieties of molluscan Rapana venosa and arthropodan Carcinus aestuarii hemocyanins have been determined using several techniques: capillary electrophoresis, MALDI-MS, ESI-MS in combination with glycosidase digestions. Oligosaccharide composition of two FUs from the first structural subunit of Rapana venosa Hc, RvH1-a and RvH1-f, have been analysed. 5. The native subunit CaSS2 of crab Carcinus aestuarii is a polypeptide of 650 amino acid residues with a molecular weight determined to be 75036 Da which agrees with the SDS-PAGE results. The primary structure of CaeSS2 shows a high degree of sequence similarity with the other crustacean hemocyanins and seems to be more homologous with Cancer magister subunit 6 (73%). 10 Trp and 28 Tyr residues were identified in CaeSS2 and classified into three classes with fluorescence lifetimes around 0.11-0.15, 0.33 and 3.1-3.5 ns, respectively. 6. The conformation stability of arthropodan Hc Limulus polyphemus has been studied by CD and fluorescence spectroscopy. The conformational stabilities of the native dodecameric aggregates and their five isolated structural subunits towards various denaturants (pH and guanidine hydrochloride) indicate that the quaternary structure is stabilized by hydrophilic and polar forces, whereby both, the oxy- and apo-forms of the proteins are considered. Gnd.HCl-induced equilibrium denaturation of Hcs yielded a structural, partially unfolded state and a rapid conformational transition. 7. The primary structure of glycosylated Cu/Zn-superoxide dismutase from the fungal strain Humicola lutea was determined by Edman degradation. A single chain of the protein, consisting of 152 amino acid residues, reveals a very high degree (74–85%) of structural homology in comparison to the amino acid sequences of other fungal Cu/Zn-SODs. The difference of the molecular masses of H. lutea Cu/Zn-SOD, measured by MALDI-MS (15,935 Da) and calculated by its amino acid sequence (15,716 Da), is attributed to the carbohydrate chain of one mole of N-acetylglucosamine, attached to the N-glycosylation site Asn23-Glu-Ser. HL-SOD protected mice from mortality after experimental influenza A/Aichi/2/68 virus infection. Using the glycosylated HL-SOD, the survival rate is increased by 66% (protective index = 86.1%) and the survival time prolonged by 5 days, similar to the application of ribavarin, while non-glycosylated bovine SOD conferred lower protection. The results of this thesis are a further contribution to the structure, function and phylogenetic evolution of two clones of copper-containing proteins, the hemocyanins and superoxide dismutases.

Das Ziel dieser Arbeit war es die Struktur und Eigenschaften von kupferhaltigen Proteinen, Hämocyanine und Superoxiddismutasen, zu untersuchen. Beide Proteine enthalten Kupferionen in ihren Aktivzentrums und sind hilfreich in der Immunotherapie verschiedener Krankheiten. 1. Die oligomere Stabilität der Gastropoden-Hämocyanine von Rapana venosa (RvH) und Helix vulgaris und deren strukturelle Untereinheiten wurden untersucht. Zwei strukturelle Untereinheiten RvH1 und RvH2 vom Rapana venosa-Hämocyanin wurden auf einer Ionenaustauschersäule mit Hilfe von FPLC getrennt. Die Reassoziation der beiden RvH-Isoformen und des nativen Hämocyanins wurden in Puffern bei verschiedenen pH-Werten und Kalzium- und Magnesiumchlorid-Konzentrationen untersucht. Gemische von RvH–Untereinheiten reassoziieren zu Didacdecameren und Multidecameren bei Dialyse innerhalb von zwei Tagen unter Verwendung eines Dialysestabilisierungspuffers von pH 7 in Gegenwart von 100 mM Kalziumchlorid und Magnesiumchlorid. RvH1 und RvH2 unterscheiden sich sowohl biochemisch wie immonologisch; sie haben außerdem verschiedene Dissoziationseigenschaften. Für die Reassoziation, die bei pH 6 mit 2 mM Calciumclorid und Magnesiumchlorid bei 4° C innerhalb einer bis mehreren Wochen durchgeführt wurden, bilden sich Dekamere; Didekamere traten hauptsächlich mit stabilisierendem Puffer bei pH 7 auf. Höhere Kalzium- und Magnesiumionen-Konzentrationen führten zu einer rascheren Reassization von RvH1, wobei stabile Multidekamere und helikale Assoziale sich bildeten, welche bei höheren pH-Werten zu kürzeren Multidekameren und Dekameren dissoziierten. Die Reassoziationen von strukturellen Untereinheiten von RvH2 erfolgten in denselben Puffern langsamer und führten zur Bildung von Didekameren, kürzeren Aggregaten und langen Multidekameren, die jedoch bei höheren pH-Werten weniger stabil sind. Es wurde weiterhin beobachtet, dass der Rückbildungsprozess von RvH1- und RvH2- Untereinheiten mehr dem von KLH ähnelt als dem von Haliotis tuberculata-Hämocyaninuntereinheiten. 2. Es wurde eine neue Methode etabliert, um vom nativen Rapana venosa Hämocyanin funktionelle Einheiten mit Hilfe von Zinkionen zu gewinnen. Die N-terminalen Sequenzen dieser funktionellen Einheiten zeigen eine hohe Identität mit denen anderer Gastropodenhämocyanine. Nur vier funktionelle Untereinheiten, welche nach Trypsinbehandlung von RvH1 und RvH2 gewonnen wurden, zeigten eine identische N-terminale Sequenz mit denen nach Zinkbehandlung gewonnenen. 3. Aus der Gartenschnecke Helix vulgaris wurden zwei Hämocyanin-Isoformen isoliert, welche jedoch in 50 mM Calciumchlorid- und Magnesiumchloridpuffer bei pH 7 nicht vollständig reassoziierten. 4. Es wird allgemein angenommen, dass die Kohlenhydratkomponenten von Hämocyaninen für die Stimulation des Immunsystems verantwortlich sind. Von Rapana venosa- und Carcinus aestuarii-Hemocyanin wurden die Strukturen von Oligosaccharidketten durch MALDI-MS, ESI-MS in Kombination mit verschiedenen Glykosidasen bestimmt. 5. Die Primärstruktur von der Untereinheit 2 von C. aestuarii zeigt eine hohe Sequenzidentität mit der Untereinheit 1 von P.vulgaris und Untereinheit c von P.interruptus. 10 Tryptophan- und 28 Tyrosinreste wurden in der Untereinheit 2 von C. aestuarii identifiziert und durch Fluoreszenzspektroskopie untersucht. 6. Vom Limulus polyphemus-Hämacyanin wurde die Konformationsstabilität mit Circulardichroismus und Fluoreszenzspektroskopie untersucht. Dabei können fünf Proteinketten elektrophoretisch getrennt werden. Es zeigte sich, dass die strukturellen Untereinheiten eine geringere Thermostabilität aufweisen, als das native Molekül. Auch Entfernung des Kupfers aus dem Aktivzentrum führt zu einer geringeren Thermostabiltät. 7. Aus dem Pilz H. lutea wurde eine glykolisierte Kupfer-Zink-Superoxiddismutase isoliert und deren Primärstruktur bestimmt. Das Protein besitzt 152 Aminosäurereste und ist zu 74 - 85 Prozent strukturhomolog mit anderen Kupfer-Zink-Superoxid-dismutasen aus Pilzen. Durch Edman-Abbau und MALDI-Massenspektrometrie konnte nachgewiesen werden, dass ein N-Acetylglucoseminrest mit der N-Glykosy-lierungsstelle Asn23-Glu-Ser verknüpft ist. Durch Tierversuche konnte gezeigt werden, dass diese glycosylierte Kupfer-Zink-Superoxiddismutase bei Mäusen die Überlebensrate nach Virusinfektionen erhöht. Die Ergebnisse dieser Dissertation liefern einen Beitrag zur Struktur, Funktion und Phylogenese von Hämocyaninen und Superoxiddismutasen.