Malaria and host erythrocyte channels

Abstract

Malaria wird durch intrazelluläre Protozoen der Gattung Plasmodium verursacht. Der Parasit wird durch weibliche Anopheles-Mücken übertragen. Im menschlichen Wirt entwickelt er sich zuerst in Leberzellen und dann in Erythrozyten. Infizierte humane Erythrozyten erwerben dabei neue Membran-Permeabilitäten (New Permeability Pathways; NPPs), über die sowohl der Parasit ernährt wird als auch dessen Abfallprodukte entsorgt werden. Pharmokologische Hemmung der NPPs tötet den Parasiten in vitro ab. Deshalb könnten die NPPs mögliche Zielstrukturen einer neuartigen Therapie gegen Malaria sein. Zusätzlich fungieren die NPPs als Eintrittspforten, über die weitere Antimalaria-Medikamente in den Erythrozyten zu den intrazellulären Parasiten gelangen können. Darüberhinaus werden Teile der NPPs auch in nicht-infizierten alternden Erythrozyten aktiviert, wodurch der programmierte Zelltod des Erythrozyten ausgelöst wird. Funktionell sind die NPPs organische Osmolyte- und Anionen-Kanäle, die auch sehr niedrige aber signifikante Kationen-Permeabiltäten aufweisen. Werden infizierte Erythrozyten in isosmotischer Sorbitollösung suspendiert, gelangt Sorbitol über die NPPs in die Zellen; die Erythrozyten schwellen kolloidosmotisch und hämolysieren letztendlich. Die Hämolysenraten in isosmotischer Sorbitollösung spiegeln dabei direkt die Aktivitäten der NPPs wider. Nicht-infizierte Erythrozyten sind dagegen nicht permeabel für Sorbitol und bleiben intakt, wenn sie in isosmotischer Sorbitollösung inkubiert werden. Die Sorbitol-Hämolyse und die NPPs können auch in nicht-infizierten Erythrozyten durch Oxidation induziert werden. Während Oxidation und Infektion entwickeln sich die NPPs langsam. Dies deutet auf komplexe Signalabläufe während des Umbaus des oxidierten/infizierten Erythrozyten hin. Diese Doktorarbeit untersuchte die Rolle von ATP und Purinozeptoren bei der Induktion der NPPs während Oxidation oder Plasmodium-Infektion unter Verwendung von Hämolyse-Experimenten, ATP-Lumineszenz-Bestimmungen, FACS-Analyse, Patch-Clamp Ganzzellableitungen, Parasiten in vitro-Wachstumstests und in vivo Malariainfektion von Mäusen. Als Ergebnis zeigt die Arbeit, dass sowohl Oxidation als auch Plasmodium-Infektion ATP-Freisetzung aus den Erythrozyten in das Medium induzierte. Ferner erhöhten extrazelluläres ATP und weitere Purinozeptor-Agonisten die Induktion der Sorbitol-Hämolyse in oxidierten und infizierten Erythrozyten während Purinozeptor-Antagonisten sowie Degradation von extrazellulärem ATP durch Apyrase diese erniedrigten. Diese Daten deuten auf eine Beteiligung von P2Y1 und weiteren metabotropen Purinozeptoren an der Induktion der NPPs hin. Damit übereinstimmend konnte die P2Y1 Protein-Expression in humanen erythrozyten nachgewiesen werden. Ferner zeigten P2Y1-defiziente Mauserythrozyten erniedrigte P. berghei-Infektion- bzw. Oxidation-induzierte Sorbitol Hämolyse im Vergleich zu Erythrozyten der Wildtyp-Geschwister. Auch hemmte der unspezifische Purinozeptor-Antagonist Suramin in vitro die intraerythrozytäre Parasitenvermehrung und -DNA/RNA-Synthese sowie die Induktion der NPPs in der Membran des infizierten Erythrozyten. Darüberhinaus zeigten P. berghei-infizierte P2Y1-defiziente Mäuse eine niedrigere Parasitämie und längere Überlebenszeiten als ihre Wildtypgeschwister. Schlussendlich befasste sich diese Arbeit mit einer möglichen Rolle der NPPs für den programmierten Zelltod humaner Erythrozyten. Gealterte Erythrozyten zeigen Merkmale von apoptotischen kernhaltigen Zellen wie Zellschrumpfung, Abschnüren von Membranbläschen und Zusammenbruch der Phospholipid-Asymmetrie der Plasmamembran. Der programmierte Erythrozytentod wird durch die erhöhte Aktivität von nicht-selektiven Ca2+-permeablen Kationenkanälen ausgelöst. Diese oder sehr ähnliche Kationenkanäle werden - als kleine Fraktion der NPPs - auch in Plasmodium-infizierten Erythrozyten aktiviert. Die vorliegende Arbeit konnte zeigen, dass die Plasmodium-Infektion den Zusammenbruch der Phospholipid-Asymmetrie des Wirtserythrozyten induzierte, ein Prozess, der in nicht-infizierten Zellen durch erhöhte zytosolische freie Ca2+ Konzentrationen imitiert werden konnte. Zusammenfassend zeigt die vorliegende Arbeit die Beiteiligung von ATP-Freisetzung und Purinozeptoren an der Induktion der NPPs in Plasmodium-infizierten Erythrozyten. Sie demonstriert auch zum ersten Mal die Expression von P2Y1 Rezeptoren in humanen Erythrozyten. Oxidative Prozesse sind sehr wahrscheinlich an der Kommunikation zwischen intraerythrozytärem Parasiten und Erythrozytenembran beteiligt, da chemische Oxidation diejenigen Prozesse imitiert, die zur Bildung der NPPs während der Plasmodium-Infektion führen. Der hemmende Effekt von Purinozeptor-Antagonisten und P2Y1-Defizienz auf die Parasitenentwicklung in vitro bzw. in vivo weist auf die funktionelle Signifikanz der Purinozeptor-Signaltransduktionskaskade für die Malariainfektion beim Menschen hin.

Malaria is caused by intracellular protozoan of the genus Plasmodium. The parasite is transmitted by the female Anopheles mosquito and within the human host it develops first in liver cells and then in erythrocytes. Parasitized human erythrocytes (RBCs) acquire new membrane permeabilities (New Permeability Pathways; NPPs) to meet the needs in nutrients and disposal of waste products of the intensively growing parasite. In vitro pharmacological inhibition of the NPPs results in parasite death. Therefore, the NPPs are potential targets for antimalarial drugs. In addition, the NPPs serve for entry routes of other drugs into the RBC thus delivering the drugs to the intraerythrocytic parasite. Moreover, a fraction of the NPPs has recently been shown to be activated in non-infected RBCs during aging and to trigger programmed cell death. Functionally, the NPPs are organic osmolyte and anion channels with additional low but significant cation permeability. Therefore, suspending parasitized RBCs in isosmotic sorbitol solution leads to sorbitol entry, colloidosmotic swelling and eventually hemolysis. The rate of hemolysis in isosmotic sorbitol solution reflects the activity of the NPPs. Non-infected RBCs, in contrast, are not sorbitol permeable and stay intact when bathed in isosmotic sorbitol solution. NPPs and sorbitol hemolysis can also be induced in non-infected RBCs by oxidative stress. Upon oxidation and during infection the NPPs develop slowly suggesting complex signaling and reorganization of the oxidized/parasitized RBCs This study investigates the role of ATP and purinoceptors in the induction of the NPPs upon oxidation or during Plasmodium infection by the use of hemolysis experiments, ATP luminescence assay, FACS analysis, patch-clamp whole-cell recordings, parasite in vitro growth assays and in vivo malaria infection of mice. As a result, both, oxidation and Plasmodium infection, induce ATP release from the RBCs into the medium. Extracellular ATP and further purinoceptor agonists increase and antagonists (e.g. MRS2179, P2Y1 receptors specific antagonist) as well as extracellular ATP degradation by apyrase decrease the induction of the sorbitol hemolysis in oxidized or parasitized RBCs. These data suggest the involvement of P2Y1 and further metabotropic purinoceptors in the induction of the NPPs. Accordingly, human RBCs express P2Y1 protein and P2Y1-deficient mouse erythrocytes exhibit a decreased P. berghei infection- or oxidation-induced sorbitol hemolysis as compared to their wildtype litter-mates. Moreover, the non-specific purinoceptor antagonist suramin decreases in vitro the intraerythrocytic parasite amplification and DNA/RNA synthesis of P. falciparum as well as the induction of the NPPs in the membrane of the parasitized RBC. Furthermore, P. berghei-infected P2Y1-deficient mice exhibit lower parasitemia and higher survival rates as compared to their wildtype litter mates. Finally, this study focuses on the possible role of the NPPs for the programmed death of human RBCs. Aged RBCs express features characteristic for apoptosis in nucleated cells such as cell shrinkage, membrane blebbing and breakdown of the phosphatidylserine asymmetry of the plasma membrane. Programmed RBC death is triggered by the increased activity of a non-selective Ca2+-permeable cation channel which - as an identified fraction of the NPPs - is also activated in Plasmodium-infected RBCs. Accordingly, the present study demonstrates that Plasmodium infection induces breakdown of the phosphatidylserine asymmetry of the parasitized RBCs, a process mimicked in non-infected cells by increased cytosolic free Ca2+ concentrations. In conclusion, this study shows that the induction of the NPPs in Plasmodium-infected erythrocytes involves ATP release and purinoceptors signaling. It also demonstrates for the first time the protein expression of P2Y1 receptors by human erythrocytes. Since chemical oxidation mimics the processes leading to the NPPs formation during Plasmodium infection, oxidative processes are probably involved in the signaling between the intraerythrocytic parasite and the RBC membrane. The inhibitory effect of purinoceptor antagonist and P2Y1 deficiency on parasite development in vitro and in vivo, respectively, strongly suggests functional significance of the purinoceptor signaling for the malaria infection in human beings.