Umsatz von extrazellulärem Glutathion und Glutathiondisulfid durch Gehirnzellen

Abstract

Reduziertes Glutathion (GSH) spielt im Gehirn eine bedeutende Rolle bei der Beseitigung reaktiver Sauerstoffspezies und trägt damit zum Schutz des Organs vor oxidativem Stress bei. Oxidativer Stress wird als Symptom oder mögliche Ursache neurodegenerativer Erkrankungen diskutiert.

Im Rahmen dieser Arbeit sollte der Stoffwechsel von extrazellulärem GSH und Glutathiondisulfid (GSSG) von Gehirnzellen untersucht werden. Dabei wurden Vorkommen und Modulation der gammaGlutamyltranspeptidase (gammaGT) als extrazelluläres GSH-abbauendes Enzym in neuralen Zellen sowie der Verbleib extrazellulären Glutathiondisulfids (GSSG) in neuralen Zellkulturen untersucht.

Das Vorkommen von gammaGT konnte in allen vier verwendeten neuralen Zellkulturtypen (astrogliareiche und neuronenreiche Primärkulturen (APK bzw. NPK), microgliareiche und oligodendrogliareiche Sekundärkulturen (MSK bzw. OSK)) nachgewiesen werden, wobei die spezifische Aktivität in Astrogliazellen am höchsten war. Die Aktivität der gammaGT stieg in APK in Anwesenheit von Tumor-Nekrose-Faktor alpha (TNFalpha) innerhalb von 72 h auf das 4,5fache des Ausgangswertes an. Mit steigender Konzentration an TNFalpha erhöhte sich die spezifische Aktivität der gammaGT. Der TNFalpha-abhängige Anstieg der gammaGT-Aktivität konnte durch Gaben des gammaGT-Inhibitors Acivicin verhindert werden. Der Proteinbiosyntheseinhibitor Cycloheximid unterdrückte die Erhöhung der gammaGT-Aktivität durch TNFalpha. Somit beruhte der TNFalpha-induzierte Anstieg der spezifischen gammaGT-Aktivität in APK auf einer de novo-Synthese des Proteins. Physiologisches Substrat der gammaGT ist extrazelluläres GSH. Die durch TNFalpha erhöhte Aktivität der gammaGT bewirkte, daß von APK exportiertes GSH signifikant schneller abgebaut wurde als in Kontrollen ohne TNFalpha. Nach Inkubation von APK mit Lipopolysacchariden und Interferon gamma oder dem Stickstoffmonooxiddonor Nitroprussidnatrium konnte ebenfalls ein Anstieg der spezifischen gammaGT-Aktivität beobachtet werden. Eine Steigerung der spezifischen gammaGT-Aktivität in APK sowie ein erhöhter Eisengehalt der Zellen wurde nach Inkubation mit Eisenionen in Form von Ammoniumeisen(III)citrat erreicht. Nach Überexpression der gammaGT durch adenoviralen Gentransfer in verschiedenen neuralen Zelltypen konnte eine 1000 bis 2500fache Erhöhung der spezifischen gammaGT Aktivität gemessen werden. Die Transfektionsrate lag dabei bei ca. 20 %. Die intrazelluläre GSH-Konzentration war bei gammaGT-überexprimierenden Zellen im Vergleich zu Kontrollzellen verringert.

Extrazelluläres GSSG verschwand in Anwesenheit von Cystin in intakten APK oder APK-Lysaten oder zellfreien Extrakten daraus. Dabei war der Umsatz von extrazellulärem GSSG abhängig von der eingesetzten Lysatmenge, der Konzentration der Substrate und vom pH-Wert des eingesetzten Puffers. Der GSSG-Umsatz war in intakten Zellen spezifisch für das Substrat L-Cystin. Im Gegensatz dazu wurde GSSG in Überständen von APK-Lysaten auch in Anwesenheit von D-Cystin, (CysGly)2 und (GlyCys)2 umgesetzt. Inhibiert wurde der Umsatz von GSSG in intakten Zellen durch 5,5'-Dithio-bis(nitrobenzoesäure), Iodacetamid und CuSO4, in Lysatüberständen außerdem durch Bacitracin. Massenspektrometrische Analysen von Reaktionsansätzen mit Lysatüberständen ergaben bei dem Umsatz von GSSG ein verstärktes Signal bei 428,1 m/z im Vergleich zu Kontrollen. Die Signale der Molekülionen von GSSG und Cystin nahmen dagegen im Vergleich zu den Kontrollen in Anwesenheit von Lysatüberstand ab. Das Molekülion mit 428,1 m/z wurde durch Fragmentierung als gemischtes Disulfid aus GSH und Cystein identifiziert. Die Stöchiometrie der Reaktion von je einem Molekül GSSG und Cystin zu zwei Molekülen des gemischten Disulfids wurde durch die Signalintensitäten der Molekülionen bei der massenspektrometrischen Analyse bestätigt.

In brain, reduced glutathione (GSH) is an important scavenger of reactive oxygen species and protects the organ against oxidative stress. Oxidative stress is discussed as symptom or cause of neurodegenerative diseases.

In this thesis the metabolism of extracellular GSH and oxidized glutathione (GSSG) was investigated. For this purpose occurance and modulation of the extracellular GSH-degrading enzyme gamma-glutamyl transpeptidase (gammaGT) as well as the fate of extracellular GSSG was investigated.

GammaGT was detectable in cultured astrocytes, neurons, microglia and oligodendrocytes with the highest specific activity found in astrocytes. In the presence of tumor necrosis factor alpha (TNFalpha) specific activity of gammaGT in astroglial cultures increased 4,5-fold within 72 h. GammaGT activity increased with increasing concentrations of TNFalpha. Acivicin, a gammaGT inhibitor, and cycloheximide, an inhibitor of protein biosynthesis, inhibited the TNFalpha-dependet increase in gammaGT activity. Thus, TNFalpha-induced increase of specific gammaGT activity in astroglial cultures was dependent on a de-novo-synthesis of the enzyme. Physiological substrate of gammaGT is extracellular GSH. The TNFalpha-dependent increase in gammaGT activity resulted in a significant higher degradation of GSH than in controls incubated in the absence of TNFalpha. Incubation of astroglial cultures in the presence of lipopolysaccharides and interferon gamma or the nitric oxide donor sodium nitroprusside also resulted in an increase in specific gammaGT activiy. In addition, an increase in specific gammaGT activity as well as an increased iron content in cells was observed after incubation of astroglial cultures in the presence of ammonium iron(III) citrate. After overexpression of gammaGT in different neural celltypes via adenoviral gene transfer a 1000-2500fold increase in gammaGT activity was detected. About 20 % of the cells were transfected. In cells overexpressing gammaGT the intracellular GSH-content was reduced compared to controls.

Extracellular GSSG disappeared in astroglial cutlures, lysates of astroglial cultures or lysate supernatants in the presence of cystine. The turnover of GSSG was dependent on the amount of lysate applied, the substrate concentration and the pH-value of the applied buffer. In intact cell cultures turnover of GSSG was specific for the substrate L-cystine. In lysate supernatant GSSG was also metabolized in the presence of D-cystine, (CysGly)2 and (GlyCys)2. GSSG-turnover was inhibited in intact cells by 5,5'-dithio-bis(nitrobenzoic acid), iodoacetamide and CuSO4, in lysate supernatant also by bacitracin. Mass spectrometric analyses of GSSG-turnover in lysate supernatant showed a strong peak at 428,1 m/z compared to controls. The intensity of the substrate peaks of GSSG and cystine was decreased compared to controls. After fragmentation the molecule ion with 428,1 m/z was identified as a mixed disulfide of GSH and cysteine. The stoichiometry of the reaction of one molecule GSSG and cystine each to form two molecules of mixed disulfide was confirmed by the signal intensities of mass spectrometric analyses.