The small GTPase Arf1p from Saccaromyces cerevisiae goes new ways - Novel roles in mRNA transport and in the formation of specialized vesicles from the Golgi -

Abstract

The small GTPase Arf1 is a crucial regulator of vesicle formation at many steps of the secretory pathway in the yeast Saccharomyces cerevisiae as well as in higher eukaryotes. Currently best understood is the role of Arf1 in the formation of COPI-coated vesicles at different levels of the Golgi apparatus. In addition, there is growing evidence of Arf1 being involved in actin cytoskeleton rearrangements as well as in lipid metabolism. The variety of already known regulators and effectors of Arf1 is, however, still insufficient to explain the multiple functions of the same molecule at different cellular locations. Furthermore, it is likely that new Arf1-dependent pathways await discovery in both yeast and mammals. In this study, a differential affinity chromatography approach was used to identify new interactors of Arf1p from Saccharomyces cerevisiae cytosol. One of the new interactors of activated Arf1p that was identified was the polyA-binding protein Pab1p, which binds to the polyA-tail of mRNA. Pab1p was found to associate with purified COPI-coated vesicles generated from Golgi membranes in vitro. The stability of the Arf1p-Pab1p complex depends on the presence of mRNA. Both symmetrically distributed mRNAs as well as the asymmetrically distributed ASH1 mRNA are found in association with Arf1p. Remarkably, Arf1p and Pab1p are both required to restrict ASH1 mRNA to the bud tip. Arf1p and coatomer play an unexpected role in localizing mRNA independent and downstream of the SHE machinery. Hereby acts the SHE machinery in long-range mRNA transport while COPI vesicles could act as short-range localization vehicles. The ER-Golgi shuttle might be involved in concentrating mRNA at the ER. Other interactors of activated Arf1p identified were Chs5p and Bch1p, a member of the Bud7-Chs6 family. In this study, I showed that all members of this new and previously uncharacterized fungi-specific protein family physically interact with Arf1p and Chs5p. Moreover, the Bud7-Chs6 family proteins interact with one another and form higher molecular weight complexes. In addition, they are all at least partially localized to the trans-Golgi network. Most importantly, at least Bud7p and Bch2p are found on vesicles generated from Golgi membranes in vitro. The Bud7-Chs6 family is required for trafficking of specific cargo molecules like the chitin synthase Chs3p from the trans-Golgi-network to the mother-bud neck and plays a role in bud-site selection. These functions of the Bud7-Chs6 family proteins converge in Chs5p. Finally, I propose that the Bud7-Chs6 family proteins act as cargo receptors and are involved in Arf1p-dependent post-Golgi transport steps of fungi-specific cargo molecules directed to the mother-bud neck.

Die kleine GTPase Arf1 ist ein entscheidender Regulator bei der Vesikelbildung an vielen Stellen des sekretorischen Wegs in der Hefe S. cerevisiae und ebenso in höheren Eukaryoten. Momentan ist die Funktion von Arf1 bei der Bildung von COPI-Vesikeln am besten charakterisiert. Es gibt aber auch immer mehr Hinweise darauf, dass Arf1 an der Umbildung des Actin-Cytoskeletts beteiligt ist und ebenso den Lipid-Metabolismus beeinflusst. Die große Vielfalt an schon bekannten Interaktoren von Arf1 ist jedoch immer noch nicht ausreichend, um die multiplen Funktionen ein und desselben Moleküls an verschiedenen zellulären Orten zu erklären. Es ist außerdem wahrscheinlich, dass weitere Arf1-abhängige Wege in Hefen und höheren Eukaryoten noch gar nicht entdeckt wurden. In dieser Arbeit wurde eine differenzielle Affinitätschromatographie durchgeführt, um neue cytosolische Interaktoren von Arf1p aus S. cerevsiae zu identifizieren. Einer der neu gefundenen Interaktoren von aktiviertem Arf1p war das PolyA-bindende Protein Pab1p. Es wurde gefunden, dass Pab1p mit aufgereinigten COPI-Vesikeln assoziiert ist, die aus Golgi Membranen in vitro hergestellt wurden. Die Stabilität des Arf1p-Pab1p Komplexes war ab hängig von mRNA. Sowohl symmetrische mRNAs als auch die asymmetrisch verteilte ASH1 mRNA waren mit Arf1p assoziiert. Bemerkenswerterweise waren sowohl Arf1p als auch Pab1p nötig, um ASH1 mRNA auf die Knospungspitze zu beschränken. Arf1p und Coatomer spielen eine unerwartete Rolle in der Lokalisierung von mRNA. Diese ist unabhängig von der SHE Maschinerie und ihr nachgeschaltet. Die SHE Maschinerie agiert hier als Langstrecken-Transportsystem, während COPI-Vesikel kurze Strecken überbrücken könnten. Der ER-Golgi Pendelverkehr könnte daran beteiligt sein, mRNA am ER zu konzentrieren. Weitere neue Interaktoren waren Chs5p und Bch1p, ein Mitglied der Bud7-Chs6 Familie. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass alle Mitglieder dieser pilzspezifischen Proteinfamilie physikalisch mit Arf1p und Chs5p wechselwirken. Darüber hinaus interagieren die Proteine der Bud7-Chs6 Familie miteinander und bilden höhermolekulare Komplexe. Alle sind zumindest teilweise am trans-Golgi Netzwerk lokalisiert und außerdem sind Bud7p und Bch2p auf Vesikeln zu finden. Die Bud7-Chs6 Familie ist nötig für den Transport von spezieller Proteinfracht wie etwa der Chitin Synthase Chs3p vom trans-Golgi-Netzwerk zum Knospungshals und spielt eine Rolle bei der Auswahl der Knospungsstellen. Diese Funktionen der Bud7-Chs6 Familie konvergieren in Chs5p. Es wird vorgeschlagen, dass die Mitglieder der Bud7-Chs6 Familie als neuartige Fracht-Rezeptoren fungieren und beteiligt sind an Arf1p-abhängigen post-Golgi Transportschritten hin zum Knospungshals.