Untersuchungen zur Expression des Cytochrom P450 3A4 und zur Expression und transkriptionellen Regulation des Pregnan-X-Rezeptors im Menschen

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dc.contributor.advisor Eichelbaum, Michel de_DE
dc.contributor.author Wolbold, Renzo de_DE
dc.date.accessioned 2004-08-13 de_DE
dc.date.accessioned 2014-03-18T10:12:56Z
dc.date.available 2004-08-13 de_DE
dc.date.available 2014-03-18T10:12:56Z
dc.date.issued 2004 de_DE
dc.identifier.other 113127693 de_DE
dc.identifier.uri http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:21-opus-13373 de_DE
dc.identifier.uri http://hdl.handle.net/10900/48630
dc.description.abstract Um der Exposition gegenüber Pharmaka, anderen Xenobiotika und potentiell schädigenden Metaboliten endogener und exogener Herkunft zu begegnen, besitzen viele Organismen ein Biotransformationssystem, durch welches diese Verbindungen durch chemische Modifikation oftmals unschädlich und ausscheidbar gemacht und schließlich aus dem Organismus eliminiert werden. Ein wichtiger Bestandteil des Biotransformationssystems sind die Cytochrom P450 Monooxygenasen. Cytochrom P450 3A4 (CYP3A4) ist mengenmäßig das bedeutendste P450 Isoenzym in der Leber des Menschen und ist an der Verstoffwechslung von mehr als 50% aller gegenwärtig in der Therapie eingesetzten Wirkstoffe beteiligt. Die Genexpression und enzymatische Aktivität von CYP3A4 ist von beträchtlicher interindividueller Variabilität. Eine durch Induktionsprozesse bedingte Regulation der Genexpression und genetische Polymorphismen werden als mögliche Ursachen angesehen. Die Induktion von CYP3A4 und einer Reihe anderer wichtiger Proteine der Biotransformation durch bestimmte Induktoren wird unter anderem durch den Pregnan-X-Rezeptor (PXR), ein Mitglied der Superfamilie der Kernrezeptoren, vermittelt. Diese ligandenaktivierbaren Transkriptionsfaktoren regulieren und modulieren die Transkription ihrer Zielgene durch Interaktion mit regulatorischen DNA Bereichen, anderen Transkriptionsfaktoren, Co-Aktivatoren und -Repressoren und Bestandteilen der zellulären Transkriptionsmaschinerie. Obwohl PXR als ein zentraler upstream regulator der Biotransformation an der transkriptionellen Kontrolle mehrerer xenobiotika-metabolisierender Enzyme und Transporterproteine beteiligt ist, war über Mechanismen der Regulation des menschlichen PXR Gens selbst bisher nichts bekannt. Es lagen jedoch Hinweise vor, dass die Expression des PXR Gens durch den Hepatocyte Nuclear Factor 4alpha (HNF4alpha), den Glucocorticoidrezeptor und durch PXR selbst reguliert wird. In der vorliegenden Arbeit wurde die Expression des Cytochrom P450 3A4 und des Pregnan-X-Rezeptors in der Leber und im Darm des Menschen untersucht und ein möglicher Zusammenhang zwischen beiden Parametern überprüft. Weiterhin wurde der Einfluss der individuellen PXR Expression auf die Induzierbarkeit des intestinalen CYP3A4 und P-Glykoprotein durch den PXR-Agonisten Rifampicin untersucht. Schließlich wurde die 5´ flankierende Region des PXR Gens charakterisiert, um cis-acting Elemente und trans-acting Faktoren, die an der Regulation von PXR beteiligt sind, zu identifizieren. Bei der Expressionsanalyse von CYP3A4 in menschlicher Leber anhand einer Gewebebank von 94 Patientenproben konnte die bekannte interindividuelle Variabilität sowohl auf der Protein- als auch auf der mRNA-Ebene bestätigt werden. Außerdem wurde ein Geschlechtsdimorphismus bei der Expression von CYP3A4 gefunden. In Leberproben von Frauen war die durchschnittliche CYP3A4 Protein- und mRNA Expression jeweils signifikant höher als in Proben von Männern. Auch die PXR Expression war von beträchtlicher Variabilität, sie schwankte in der Leber um einen Faktor von mehr als 17 und war mit der Expression der CYP3A4 mRNA sowohl in der Leber als auch im Darm korreliert. Bei der Untersuchung der intestinalen Induzierbarkeit von CYP3A4 und MDR1 durch Rifampicin anhand von Duodenalbiopsien wurde eine Ko-Induktion von CYP3A4 und MDR1 gefunden, die individuelle PXR Expression war jedoch nicht ausschlaggebend für das Induktionsausmaß. Für die Charakterisierung der 5´-flankierenden Region des PXR Gens wurde zunächst die Transkriptionsstartstelle identifiziert. Dabei wurden unterschiedliche Haupttranskriptionsstartstellen in der Leber und im Darm des Menschen gefunden. Eine Plasmidbibliothek von Reportergenkonstrukten mit unidirektionalen Verkürzungen des von Position –2543 bis +195 relativ zum Transkriptionsstart in der Leber subklonierten PXR-Promotors wurde generiert. Durch transiente Transfektionsexperimente mit dieser Plasmidbibliothek und ortsgerichtete Mutagenese der 5´-flankierenden Region wurde ein Kernrezeptor response element (RE) vom DR1 Typ identifiziert, das für die Aktivität des PXR Promotors in den etablierten Zellinien LS174T und HepG2 von essentieller bzw. erheblicher Bedeutung ist. In in vitro DNA Bindungsexperimenten wurde gezeigt, dass HNF4alpha spezifisch an dieses RE bindet. Das identifizierte HNF4alpha-RE war für die Responsivität des PXR-Promotors gegenüber exogenem HNF4alpha1 verantwortlich und war in der Lage, eine Responsivität gegenüber HNF4alpha1 auf einen heterologen Promotor zu vermitteln. Die Kernrezeptoren COUP-TFI und COUP-TFII, die als hemmend wirksame Faktoren auch als funktionelle Antagonisten zu HNF4alpha wirken können, inhibierten die Aktivität des PXR-Promotors in Abhängigkeit vom Vorhandensein des funktionellen HNF4alpha-RE ohne jedoch direkt an dieses zu binden, d.h. vermutlich durch eine trans-Repression. Für eine Beteiligung des Glucocorticoidrezeptors oder PXR selbst an der Regulation der Transkription von PXR wurden keine Belege gefunden. de_DE
dc.description.abstract Many organisms possess xenobiotic metabolizing enzymes which, by chemical modification and transportation, are able to detoxify and eliminate drugs, xenobiotics and other potentially harmful compounds of exogenous or endogenous origin. Cytochrome P450 monooxygenases (CYP) are an important part of this biotransformation system. Cytochrome P450 3A4 (CYP3A4) is the most abundant CYP isoform in human liver and is involved in the metabolism of more than 50% of all drugs currently in therapeutic use. Gene expression and enzymatic activity of CYP3A4 are of considerable interindividual variability, which is assumed to be caused by induction of gene expression and genetic polymorphisms. The induction of CYP3A4 and several other important drug metabolizing enzymes and transporters by distinct compounds is mediated by the pregnane x receptor (PXR) which is a member of the family of nuclear receptors. These ligand-activated transcription factors regulate and modulate their target genes´ transcription through interaction with regulatory DNA sequences, other nuclear receptors, transcription factors, and coactivators and corepressors. Although PXR plays a central role as a regulator of several xenobiotic metabolizing enzymes and transporters, and although there were indications for an involvement of the hepatocyte nuclear factor 4alpha (HNF4alpha), the glucocorticoid receptor, and PXR itself, the regulation of PXR expression itself was not well understood. In this dissertation, the expression of CYP3A4 and PXR in human liver and intestinal tissue and the relationship between these two parameters was examined. Furthermore, the impact of individual PXR expression levels on the inducibility of intestinal CYP3A4 and p-glycoprotein by the PXR agonist rifampicin was examined. Finally, the 5´ flanking region of the human PXR gene was characterized in order to identify cis-acting elements and trans-acting factors involved in the regulation of PXR transcription. Expression analysis of CYP3A4 in a tissue bank of human liver samples of 94 individuals confirmed the well-known interindividual variability of CYP3A4 expression on the protein and mRNA level. Furthermore, a sex-dependent dimorphism of CYP3A4 expression was observed. In liver samples obtained from women, the average CYP3A4 protein and mRNA expression was significantly higher than in those obtained from men. The expression of PXR was considerably variable as well, varying more than 17-fold in liver, and was correlated with CYP3A4 mRNA expression in liver as well as in intestinal tissue. Analysis of intestinal inducibility of CYP3A4 and MDR1 mRNA by rifampicin using duodenal biopsies showed that CYP3A4 and MDR1 mRNA are co-induced, but the individual PXR expression was found to be no determining factor for the extent of induction. In order to characterize the 5´ flanking region of the human PXR gene, the transcriptional start site was identified first. It was found that the major transcriptional start sites in human liver and intestinal tissue are slightly different. Subsequently, a library of reporter gene constructs with unidirectional deletions of the PXR promoter region ranging from –2543 to +195 relative to the transcriptional start site in human liver tissue was generated. Performing transient transfection experiments with this library and site-directed mutagenesis of the 5´ flanking region, a DR1 type nuclear receptor response element (RE) was identified, which was essential for or had considerable impact on promoter activity in LS174T and HepG2 cells. The RE bound HNF4alpha specifically, mediated responsivity towards exogenous HNF4alpha1 to the PXR promoter and was able to confer responsivity towards HNF4alpha1 to a heterologous promoter. The nuclear receptors COUP-TFI and COUP-TFII, which are known to exert mostly inhibitory functions and are able to act as functional antagonists of HNF4alpha, were shown to inhibit PXR promotor activity dependent on the integrity of the functional HNF4alpha-RE, but without binding directly to the RE, suggesting a trans-repression mode. No indications were found for an involvement of the glucocorticoid receptor or PXR itself in the transcriptional regulation of PXR. The observed sex-dependent dimorphism of CYP3A4 expression could provide an explanation for previously reported sex-dependent differences in the metabolism of certain drugs and should be taken into consideration in the development and evaluation of drugs which are substrates of CYP3A4. The characterization of the promoter region of the nuclear receptor PXR and the identification of factors involved in its transcriptional regulation lead to a better understanding of the complex regulatory network and signal transduction pathways of the biotransformation system. Using the promoter reporter gene construct library of the 5´ flanking region of the human PXR gene, it should be possible to further clarify the regulation of PXR transcription. en
dc.language.iso de de_DE
dc.publisher Universität Tübingen de_DE
dc.rights ubt-podok de_DE
dc.rights.uri http://tobias-lib.uni-tuebingen.de/doku/lic_mit_pod.php?la=de de_DE
dc.rights.uri http://tobias-lib.uni-tuebingen.de/doku/lic_mit_pod.php?la=en en
dc.subject.classification Kernrezeptor de_DE
dc.subject.ddc 540 de_DE
dc.subject.other Fremdstoffmetabolismus , CYP3A4 , PXR , HNF4alpha de_DE
dc.subject.other xenobiotic metabolism , CYP3A4 , nuclear receptors , PXR , HNF4alpha en
dc.title Untersuchungen zur Expression des Cytochrom P450 3A4 und zur Expression und transkriptionellen Regulation des Pregnan-X-Rezeptors im Menschen de_DE
dc.title Studies on the expression of Cytochrome P450 3A4 and expression and transcriptional regulation of the Pregnane X Receptor in humans en
dc.type PhDThesis de_DE
dcterms.dateAccepted 2004-03-18 de_DE
utue.publikation.fachbereich Sonstige - Chemie und Pharmazie de_DE
utue.publikation.fakultaet 7 Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät de_DE
dcterms.DCMIType Text de_DE
utue.publikation.typ doctoralThesis de_DE
utue.opus.id 1337 de_DE
thesis.grantor 14 Fakultät für Chemie und Pharmazie de_DE

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