Isolierung und Charakterisierung thermophiler Proteasen aus Bakterien

Abstract

Im Rahmen dieser Arbeit ist es gelungen, neue intrazelluläre und extrazelluläre Proteasen aus den thermophilen Bakterienstämmen Thermus thermophilus HB8 und Bacillus caldolyticus zu isolieren. Zwei intrazelluläre Proteaseaktivitäten aus T. thermophilus HB8 konnten unterschieden und getrennt werden. Eine der beiden Proteasen wurde vollständig gereinigt und bezüglich ihrer Spezifität, Größe und Primärstruktur charakterisiert. Die Untersuchung der katalytischen Aktivität des Enzyms aus T. thermophilus HB8 mit Hilfe unterschiedlicher synthetischer Substrate wies auf eine bevorzugte Hydrolyse der Säureamidbindung unter Beteiligung aromatischer Aminosäurereste hin. Ferner bewirkte der spezifische Serinprotease-inhibitor 4-(2-Aminoethyl)benzolsulfonyl-fluoridhydrochlorid in Abhängigkeit von der eingesetzten Konzentration eine vollständige Inaktivierung der Protease, was ebenso auf eine Serinprotease mit chymotrypsinähnlicher Spezifikation hinweist. Die Größenbestimmung der gereinigten Protease aus T. thermophilus HB8 erfolgte mit mehreren Methoden wie SDS-PAGE, Gelchromatographie, kovalente Quervernetzung und anschließendem SDS-PAGE. Es wurde ein Temperaturmaximum bei 90°C und ein pH-Optimum von 8, unter Verwendung des Substrats Ala-Ala-Phe-AMC für die Protease gefunden. Zusätzlich wurde für dises Substrat die Michaelis-Konstante unter den beschriebenen Bedingungen zu 200 µM bestimmt. Die Bestimmung der N-terminalen Sequenz der Protease aus T. thermophilus HB8 nach Edman ergab eine definierte Abfolge aus 20 Aminosäuren. Ferner konnten durch tryptischen Verdau dieser Protease interne Peptide erzeugt werden, deren Sequenz mit dem LC-MS/MS-Experiment ermittelt und zur Identifizierung der Proteine mit Hilfe von Datenbanken herangezogen wurde. Für die Protease konnte keine homologe oder ähnliche Sequenz gefunden werden, es handelt sich offensichtlich um ein noch nicht identifiziertes Protein dieser Gattung. Die Kultivierung des Bakterienstamms B. caldolyticus unter den beschriebenen Bedingungen führte zur Anreicherung extrazellulärer Proteasen im Kulturmedium. Zwei verschiedene Formen extrazellulärer Proteasen, welche sich hinsichtlich ihrer Größe unterschieden, konnten in Reinform gewonnen werden.

This work describes the effective isolation of new intracellular and extracellular proteases from the thermopilic bacterial strains Thermus thermophilus HB8 and Bacillus caldolyticus. Two different protease activities from T. thermophilus HB8 were identified and separated. One of these activities was purified to homogeneity and characterised with regard to specifity, size and structure. Investigations of the catalytic activity of the described enzyme from T. thermophilus HB8 using different synthetic substrates showed preferred hydrolysis for aromatic amino acids. Further examinations with the specific serine protease inhibitor 4-(2-aminoethyl)-benzenesulfonyl-fluoride hydrochloride resulted in the complete inactivation of the protease indicating that the isolated protease was a type of serine protease with chymotryptic specifity. Determination of size was performed using several methods, for example SDS-PAGE, gel chromatography, covalently crosslinking experiment, following SDS-PAGE separation. The temperature maximum and the pH optimum of the isolated proteases was studied using the substrate Ala-Ala-Phe-AMC and was found to be 90°C and pH 8 respectively. For this substrate the Michaelis constant was determined at the conditions described as 200 µM. The N-terminal sequence of the first 20 amino acids was determined applying the Edman degradation. Products of tryptic digestion of the isolated protease were analysed by LC-MS/MS experiment. The amino acid sequences obtained were compared with known protein sequences using a computer database. No homologous or similar sequence were found, suggesting to be a new protease of this genus. Strain B. caldolyticus was cultivated leading to the accumulation of extracellular proteases in the culture medium. Two different enzyme activities were purified and discriminated respecting to their size.