Modulation der Insulinsignalübertragung durch Proteinkinase C-katalysierte Phosphorylierung von Serin 318 im Insulinrezeptor-Substrat-1

Abstract

Diabetes mellitus Typ 2 ist heute die am weitesten verbreitete Krankheit in der westlichen Welt, doch über die Ursachen weiss man noch sehr wenig. Genetische Defekte führen im Zusammenspiel mit Umwelteinflüssen und der Regulation durch posttranslationale Modifikationen auf Proteinebene über die Insulinresistenz zu Diabetes mellitus Typ 2. Die Rolle posttranslationaler Modifikationen bei der Entstehung der Insulinresistenz ist nur zu einem geringen Teil aufgeklärt. Doch zum Verständnis dieser Krankheit und als Ansatzpunkt für denkbare pharmakologische Therapien ist es notwendig, die molekularbiologischen Ursachen aufzuklären. Die Erforschung der Modulation der Insulinsignalweiterleitung durch Serin- und Threoninkinasen-vermittelte Phosphorylierungen an Insulinrezeptor-Substrat-1 (IRS-1) ist ein Schlüssel zur Aufklärung der zugrundeliegenden Pathomechanismen. Vor kurzem wurde gezeigt, dass IRS-1 ein Substrat der Proteinkinase (PKC)-zeta ist. Die resultierende Ser-/Thr-Phosphorylierung von IRS-1 reguliert die Insulinsignalweiterleitung unter hyperinsulinämischen Bedingungen. Zur Aufklärung der molekularen Mechanismen dieser feed-back-Regulation wurde im Rahmen dieser Arbeit ein in vitro-Phosphorylierungssystem entwickelt, um bakteriell exprimierte GST-Fusionsproteine von IRS-1 durch PKC-Isoformen zu phosphorylieren. Detektion der Phosphorylierung erfolgte durch eine neu entwickelte alkalische Negativionen Scan Technik. Die Sequenzierung der Phosphopeptide wurde mit Hilfe einer Ionenfalle durchgeführt. Im Fusionsprotein GST-IRS-1 N2 (Aminosäurensequenz 265-522 der cDNA von IRS-1) wurden Ser318 und Ser436 als in vitro-Phosphorylierungsstellen der PKC-Isoenzyme zeta, delta und beta I gefunden. Mit einem Q-TOF Ultima Massenspektrometer konnten Serin24, Threonin295, Serin787, Serin790, Threonin846, Serin1083 und Threonin1102 als weitere PKC-spezifische in vitro-Phosphorylierungsstellen von IRS-1 identifiziert werden. Die Überprüfung der biologischen Relevanz wurde in Babyhamster Nierenzellen mit stabil transfiziertem Insulinrezeptor durchgeführt. Insulin, ein Aktivator der PKC-zeta hemmt die durch den Insulinrezeptor katalysierte Tyrosinphosphorylierung von IRS-1 und die Wechselwirkung zwischen dem Insulinrezeptor und IRS-1. Diese negative Modulation wird aufgehoben, wenn in IRS-1 Serin318 zu Alanin318 mutiert wird und eine Phosphorylierung an dieser Position nicht mehr möglich ist. Dadurch wurde im Rahmen dieser Arbeit gezeigt, dass Serin318 in IRS-1 der verantwortliche Aminosäurerest für die beschriebene negative Regulation der Insulinsignalweiterleitung durch PKC-zeta ist. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die Phosphorylierung an IRS-1 Ser318 einen hemmenden Effekt auf Erk2 und PKB ausübt. Dadurch könnte die Phosphorylierung an IRS-1 Serin318 durch PKC-zeta sowohl eine Modulation der Regulation der Genexpression und des Zellwachstums, als auch der Protein- und Glykogensynthese und des Glukosetransports bewirken. Serin318 wurde als erste PKC-katalysierte Phosphorylierungsstelle von IRS-1 detektiert, funktionell charakterisiert und die Regulation mit Hilfe eines selbst hergestellten polyklonalen Antikörpers nachgewiesen. Somit konnten im Rahmen dieser Arbeit erste wichtige Grundlagen zum Verständnis der PKC-vermittelten zellulären Insulinresistenz durch Phosphorylierung von IRS-1 geleistet werden.

Type 2 diabetes is the most common metabolic disorder in the Western world, but the primary factors causing this disease are unknown. Genetic predisposition and certain environmental factors alone or in combination can lead to insulin resistance. In addition posttranslational modification of insulin signaling molecules is also an important mechanism leading to impaired insulin signaling and insulin resistance and finally to type 2 diabetes. The role of posttranslational modifications in the development of insulin resistance is only poorly understood. Therefore the investigation into the regulation of insulin signaling is a key factor in the understanding of the pathogenesis of type 2 diabetes. Insulin receptor substrate-1 (IRS-1) was recently identified as an upstream substrate for protein kinase (PKC)-zeta. The resulting serine phosphorylation of IRS-1 down-regulates insulin signaling under hyperinsulinemic conditions. To clarify the molecular mechanism of this feed-back loop the aim of this thesis was to identify the currently unknown serine and threonine sites of IRS-1 which are phosphorylated by PKC and to investigate their role in insulin signaling. Serine318 was identified as a major site of PKC-zeta-phosphorylation of IRS-1 by an experimental strategy including in vitro techniques and mass spectrometry: in vitro phosphorylated GST-fusion proteins of IRS-1 were separated by electrophoresis and digested in gel. The resulting phosphopeptides were detected by a newly developed Scan technique and sequenced by an ion trap. In the fusion protein GST-IRS-1 N2 (amino acids 265-522 of the IRS-1 cDNA), ser318 and ser436 were identified as in vitro phosphorylation sites for PKC-zeta, -delta and -beta I. Using another approach with an Q-TOF Ultima mass spectrometer, ser24, thr295, ser787, ser790, thr846, ser1083 and thr1102 were identified as additional PKC-induced in vitro phosphorylation sites in IRS-1. The functional relevance of the serine318 phosphorylation in IRS-1 was investigated in baby hamster kidney cells stably expressing the insulin receptor. Insulin, a strong activator of PKC-zeta, inhibits the insulin receptor-mediated tyrosine phosphorylation of IRS-1 and the interaction of IRS-1 with the activated insulin receptor in a time dependent manner. Mutation of serine318 to alanine318, was shown to abrogate the inhibitory effect on the insulin-stimulated tyrosine phosphorylation of IRS-1. Furthermore, the negative influence of PKC-zeta on insulin signaling can also be prevented by this mutation. These results suggest that phosphorylation of serine318 might mediate, at least partially, the inhibitory effect of hyperinsulinemia on IRS-1 function, thus introducing new perspectives in the mechanisms of insulin-induced insulin resistance. Additional findings suggest that the phosphorylation of IRS-1 ser318 by PKC-zeta also takes part in the negative regulation of Erk2 (DNA/RNA synthesis) and PKB (glucose transport, glycogen synthesis, cell survival, gene transcription). In this thesis ser318 was identified as the first PKC-induced phosphorylation site of IRS-1. The importance of this site was investigated in cell culture and the regulation of ser318 phosphorylation in IRS-1 was shown using an in-house prepared polyclonal antibody.