Struktur und biologische Aktivitäten der chitinbindenden Mistellektine

Abstract

Aus Extrakten von Mistelpflanzen (Viscum album L.) wurden verschiedene Komponenten wie Aminosäuren, Flavonoide, Viscotoxine, Poly- und Oligosaccharide und Lektine isoliert. Aufgrund ihrer cytotoxischen und immunmodulatorischen Eigenschaften gilt das Hauptinteresse den Typ II Ribosomen-inaktivierenden Mistellektinen MLI, MLII und MLIII. Im Rahmen dieser Arbeit wurden drei Isomere einer neuen Klasse von Mistellektinen, die spezifisch an Chitin binden, mittels Affinitätschromatographie und Umkehrphasen-hochleistungsflüssigchromatographie (RP HPLC) aus Mistelextrakten isoliert und deren Primärstruktur bestimmt. Die chitinbindenden Mistellektine (cbML1, cbML2 und cbML3) bestehen aus jeweils zwei Polypeptidketten von 48 bzw. 49 Aminosäureresten, die über eine intermolekulare Disulfidbrücke miteinander verknüpft sind. Die Sequenzen der Monomere sind bis zur 48. Aminosäure identisch und enthalten jeweils neun Cystein- und sechs Glycinreste und außerdem vier intramolekulare Disulfidbrücken. Der zusätzliche Aminosäurerest an Position 49 der längeren Polypeptidketten ist ein Leucinrest. CbML1 besteht aus zwei verkürzten Ketten, während cbML3 aus zwei Monomeren von je 49 Aminosäureresten aufgebaut ist. CbML2 enthält eine verkürzte und eine vollständige Polypeptidkette. Die chitinbindenden Mistellektine zeigen hohe Sequenzhomologien zu Hevein aus Hevea brasiliensis (55%) und anderen Proteinen mit Hevein-ähnlichen Domänen. Auf der Grundlage von NMR- und Röntgenstrukturdaten von Hevein wurde ein dreidimensionales Modell eines cbML3-Monomers erstellt, wobei der Austausch von 26 Aminosäureresten wenig Auswirkung auf die Faltung der Kette hat. Die hochaffine Zuckerbindungsstelle ist stark konserviert. Unterschiede findet man in der Schleifenregion und in dem Bereich, der für die Dimerbildung der cbML-Proteine verantwortlich ist. Um den Gehalt an chitinbindenden Mistellektinen in Mistelextrakten zu bestimmen, wurde eine Methode etabliert, mit der kleine Mengen cbMLs aus Mistelextrakten mittels Mikroaffinitätschromatographie und RP HPLC isoliert und quantifiziert werden können. Gemäß den ICH-Richtlinien wurde eine Validierung dieses Verfahrens durchgeführt, und es wurde gezeigt, dass Spezifität, Robustheit und Präzision gewährleistet sind. Die Linearität dieser Analysenmethode liegt im Bereich von 0.6 bis 4.1 µg/ml cbML–Gehalt in den Extrakten, dabei beträgt die Wiederfindungsrate zwischen 94 und 100%. Aufgrund der Ergebnisse zur Spezifität, Präzision und Wiederfindung ist die Richtigkeit der Methode ebenfalls gewährleistet. Was den Arbeitsbereich der Analysenmethode betrifft, so können minimal 1.2 µg und maximal 8.2 µg cbMLs mit dem Affinitätsmaterial inkubiert werden. Die Nachweis- und Bestimmungsgrenze beträgt 0.13 bzw. 0.46 µg/ml cbMLs. Des Weiteren erfolgten Untersuchungen hinsichtlich immunmodulatorischer Eigenschaften der chitinbindenden Mistellektine. Seren von über mehrere Wochen mit Mistelextrakten behandelten Tumorpatienten wurden vor und während der Therapie hinsichtlich ihrer Antikörper gegen cbML3, MLI und MLIII mittels ELISA untersucht. Von den getesteten Patienten hatten 31% bereits vor Beginn der Mistelbehandlung anti-cbML3-Antikörper vom IgG-Typ, während nur 15 bzw. 4% anti-MLI- und –MLIII-Antikörper aufwiesen. Von den anti-cbML3-negativ-Patienten entwickelten 54% Antikörper gegen das chitinbindende Mistellektin im Verlauf der Therapie. Am Ende der 31. Behandlungswoche wurden bei 100 bzw. 86% der Tumorerkrankten anti-MLI- und –MLIII-Antikörper detektiert. Die chitinbindenden Mistellektine induzieren damit anti-cbML-Antikörper vom IgG-Typ, jedoch mit geringerer Antigenität als die Typ II Ribosomen-inaktivierenden Proteine der Mistel. Die Tatsache, dass bereits ein Drittel der Tumorpatienten anti-cbML3-Antikörper vor jeglichem Kontakt mit Mistelextrakten hatte, weist auf die Existenz einer „natürlichen Immunität“ hin. Die Antikörper könnten auch durch kreuzreagierende Substanzen, die ubiquitär vorkommen, z. B. Hevein, induziert worden sein. Die Induktion von IgE-Antikörpern erfolgte im Fall von cbML3 bei nur einem, im Fall von MLI und MLIII bei 7 bzw. 4 von 26 Patienten.

From extracts of mistletoe plants (Viscum album L.) different components, like amino acids, flavonoids, viscotoxins, poly- and oligosaccharides and lectins, have been isolated. The main interest has focussed on type II ribosome-inactivating mistletoe lectins MLI, MLII and MLIII because of their cytotoxic and immunomodulating properties. In this work, three isomers of a new class of mistletoe lectins, specifically binding to chitin, were isolated from mistletoe extracts by affinity chromatography and reversed phase high performance liquid chromatography (RP HPLC) and their primary structures were determined. The chitin-binding mistletoe lectins (cbML1, cbML2 and cbML3) are composed of two protein chains of 48-49 amino acid residues, linked by an intermolecular disulfide bond. The sequences of the monomers are identical up to the 48th amino acid and each contains nine cysteine and six glycine residues, additionally four intramolecular disulfide bridges. The additional amino acid residue at position 49 is a leucine residue. CbML1 consists of two truncated chains, while cbML3 consists of two monomers each of 49 amino acid residues. CbML2 contains one truncated and one full length polypeptide chain. The chitin-binding mistletoe lectins show high sequence homology to hevein from Hevea brasiliensis (55%) and to other proteins with hevein-like domains. On the basis of NMR and X-ray data of hevein a three-dimensional structure of cbML3 was modelled, in which the 26 sequence changes were accommodated with only little perturbation of the folding of the main chain. The high affinity sugar-binding site is highly conserved. Differences have been identified in the loop region and the potential interface region of cbML3. To determine the content of the chitin-binding mistletoe lectins in mistletoe extracts, a method was established to isolate and quantify small amounts of cbMLs by using microaffinity chromatography and RP HPLC. A validation, according to ICH guidelines, of this analytical method was carried out and showed that specificity, robustness and precision are guaranteed. Linearity is ensured between 0.6 and 4.1 µg/ml cbMLs in the extracts and recovery was calculated to be between 94 and 100%. Because of the results concerning specificity, precision and recovery accuracy of the method is guaranteed as well. As far as the range of the analytical method is concerned, a minimum of 1.2 µg and a maximum of 8.2 µg cbMLs can be incubated with the affinity material. Detection and quantitation limit was calculated to be 0.13 and 0.46 µg/ml cbMLs, respectively. Further tests were carried out to investigate immunomodulatory properties of the chitin-binding mistletoe lectins. Sera from tumor patients who were treated with mistletoe extracts for several weeks were analysed by ELISA with regard to antibodies against cbML3, MLI and MLIII before and during therapy. 31% of the tested patients had anti-cbML3 antibodies of the IgG type already before mistletoe therapy, while only 15 and 4%, respectively, had anti-MLI and –MLIII antibodies. 54% of the anti-cbML3 negative patients developed antibodies against the chitin-binding mistletoe lectin during therapy. Anti-MLI and –MLIII antibodies were detected in 100% and 86%, respectively, of the tumor patients after the 31st week of therapy. The chitin-binding mistletoe lectins induce anti-cbML3 antibodies of the IgG-type, but with lower antigenicity than the type II ribosome-inactivating proteins of the mistletoe. The fact that one third of the tumor patients had anti-cbML3 antibodies before any contact to mistletoe extracts indicates that there may exist some kind of “natural immunity”. On the other hand, antibodies could have been induced by cross-reacting agents existing ubiquitously such as hevein. In the case of cbML3 IgE-antibodies were detected only in one patient, whereas in the case of MLI and MLIII antibodies of the IgE-type were detected in 7 and 4, respectively, of 26 patients. Many chitin-binding proteins with hevein-like domains exert antifungal properties. To check similar activities of cbML-proteins different concentrations were incubated with five fungal species with chitin-containing cell walls. Testing cbML concentrations of maximal 150 and 300 µg/ml, respectively, no inhibition of growth was detected in the case of Tremella foliacea and Candida sake, while there was a sigificant antifungal effect in the case of the other three fungal species. IC50-values of 3.5 µg/ml in the case of Saccharomyces cerevisiae, 14 µg/ml in the case of Microstroma juglandis and 20 µg/ml in the case of Debaryomyces hanessii are comparable with IC50-values resulting from tests carried out with antifungal proteins from Amaranthus caudatus (Ac-AMPs), Pharbitis nil L. (Pn-AMPs) and Euonymus europaeus L. (Ee-CBP).