Thermodynamische und kinetische Charakterisierung von Antikörper / Hapten Paaren und Optimierung von einem Fluoreszenzimmunoassay in homogener Phase

Abstract

Zuerst wurde ein monoklonaler Anti-Estradiol-Antikörper mit Hilfe der SPR (Oberflächenplasmonenresonanz) vollständig charakterisiert. Die aktive Konzentration des Antikörpers wurde bestimmt. Die Gleichgewichtskonstanten, die kinetischen Konstanten und die thermodynamischen Variablen wurden gemessen. Die Bestimmung der Aktivität, der Affinität und der Kinetik von drei polyklonalen Antikörpern wurde mit SPR durchgeführt. Die Affinitätskonstanten wurden parallel dazu mit Reflektometrische Interferenzspektroskopie bestimmt. Die verwendeten Antikörper waren Anti-Östron, Anti-Östradiol und Anti-Östrogen. Die Analyte waren natürliche und synthetische Östrogene. Die auf der Oberfläche und in der Lösung bestimmten Affinitätskonstanten sowie die mit den zwei Methoden bestimmten Affinitätskonstanten wurden mit statistischen Tests verglichen. Für den Einsatz dieser Antikörper/Hapten-Systeme in einem Fluoroimmunoassay wurden außerdem die aktiven Konzentrationen und die Affinitätskonstanten vor und nach dem Markieren mit dem Fluorophor Cy5 gemessen. Simulierungen des Fluoroimmunoassays zeigten den Einfluss von wichtigen Parametern auf einen kompetitiven Immunoassay. Die mit SPR untersuchten Antikörper/Analyte-Systeme wurden in einem ETIA (Energietransfer Immunoassay) in Lösung eingesetzt. Der Assay wurde in Mikrotiterplatten entwickelt. Die gemessenen Kalibrierkurven wurden mit den gemessenen Affinitätskonstanten und den Simulationen verglichen. Der ETIA wurde bei verschiedenen Messungen von Östrogenen in synthetischem Abwasser validiert. Der letzte Schritt bestand in der Miniaturisierung des ETIA. Der Assay wurde erfolgreich in einer Nanotiterplatte mit einem Wellsvolumen von 70 nl gemessen. Der Fluoroimmunoassay wurde auf ein Antikörper/Protein-Paar (Vitellogenin/Anti-vitellogenin-Antikörper) angewendet. Die Fähigkeit zur Bindung von markiertem Antikörper und Protein wurde mit einem Fluoroimmunoassay in heterogener Phase geprüft.

A part of this study consisted of the characterisation of different systems of antibodies and analytes and analyte derivatives. A monoclonal anti-estradiol antibody (15H11) was fully characterised by surface plasmon resonance (SPR). The active concentration decreased with increasing dilution. The kinetic rate constants at several temperatures allowed to determine the affinity constants and thermodynamic constants. The antibody showed affinity for estradiol and ethinylestradiol and according to the thermodynamic results the binding was entropy driven. SPR was also used to characterise three polyclonal anti-estrogen antibodies. The average of active concentration of each polyclonal antibody was measured, as well as the kinetic constants and the affinity constants to several analytes and analyte derivatives. The labelling of the antibody reduced the active concentration but did not influence the affinity constants. The affinity constants were determined in parallel with another method: Reflectometric Interference Spectroscopy (RIfS). Simulations of the Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) immunoassay were calculated to show the influence of critical parameters. The different possibilities of calibration of estrone and estradiol were measured with the FRET immunoassay and it was possible to predict the FRET results according to the simulations using the measured affinity constants. The fluorescence immunoassay was applied succesfully to determine concentration of spiked analyte in synthetic waste water. The second objective concerning the fluorescence immunoassay dealt with the miniaturisation of the immunoassay. The immunoassay was successfully transferred in a nanotiterplate, where the total volume of each measurement was 70 nl. Finally the last point concerns the application of the FRET immunoassay to the vitellogenin of rainbow trout, biomarker of the presence of endocrine disruptors. No energy transfer was observed.