Isolierung, Sequenzierung und Untersuchung physikalisch-chemischer Eigenschaften von strukturellen Untereinheiten und funktionellen Einheiten verschiedener Arthropoden- und Molluskenhämocyanine

Abstract

Mit der Ermittlung der Primärstruktur der Funktionellen Einheit 'c' der Strukturellen Untereinheit KLH2 der Kalifornischen Schlüsellochnapfschnecke wurde zum ersten Mal die Aminosäuresequenz einer FE 'c' eines Gastropodenhämocyanins bestimmt. Das Protein setzt sich aus 420 Aminosäuren zusammen. Im Bereich der Bindungstellen der Kupferionen weist es große Segmente streng konservierter Bereiche auf. Die Homologie zwischen KLH2-c und der FE 'c' des Cephalopoden Octopus dofleini, bezogen auf streng konservierte Aminosäuren, beträgt 55 Im Gegensatz zu den meisten bisher bekannten Funktionellen Einheiten von Arthropoden und Mollusken enthält KLH2-c O-glykosidisch verknüpfte Zuckerstrukturen. Das native KLH ist gegenüber denaturierenden Agenzien und erhöhter Temperatur geringfügig stabiler als die einzeln vorliegenden Strukturellen Untereinheiten (SU) KLH1 und KLH2, was auf einen stabilisierenden Einfluß der SU-Aggregationen schließen läßt. Fluoreszenzmessungen ergaben, daß bis zu 65 der Energie des von Tyrosin absorbierten Lichtes strahlungslos auf Tryptophan übertragen wird, und daß die Tryptohanreste tief im Inneren der Proteinmatrix und in enger Nachbarschaft zu Tyrosinresten lokalisiert sind. Die Strukturellen Untereinheiten der Arthropoden Homarus americanus und Maja squinado wiesen mit 80 C (Homarus americanus) und 72 C (Maja squinado) eine hohe Temperaturstabilität auf. Fluoreszenzmessungen zeigten, daß die vorhandenen Tryptophanreste nicht nur in inneren Bereichen der Moleküle, sondern auch in den Berührungszonen zwischen den Strukturellen Untereinheiten des Gesamtproteins lokalisiert sind und nach der Dissoziation auf deren Oberfläche exponiert werden. Die Strukturellen Untereinheiten von Homarus americanus und Maja squinado wurden N-terminal ansequenziert und mit den Strukturellen Untereinheiten anderer Arthropoden sowie untereinander verglichen.

The determination of the primary structure of the functional unit 'c' of the structural subunit KLH2 is the very first established complete amino acid sequence of a FU 'c' of a gastropodan hemocyanin. The protein is composed of 420 amino acids and shows large segments of conserved regions mainly located at the binding positions of the copper ions. KLH2-c shows about 55 identity compared to FU 'c' from Octopus dofleini. It was noted that KLH2-c has an unusual carbohydrate structure compared to all other FUs of hemocyanins. Instead of N-linked carbohydrate chains KLH2-c contains O-linked carbohydrate chains. Against denaturing agents and increased temperature the native hemocyanin showed to be somewhat little more stable compared to the separated structural subunits KLH1 and KLH2 which allows the conclusion that aggregation of the SUs causes a stabilizing effect on the native protein. Fluorescence measurements showed that about 65 of the energy absorbed from tyrosine residues is transferred radiationless to those of tryptophan and that the tryptophan residues are located in close neighbourhood to those of tyrosine deeply buried in the core of the protein. Homarus americanus-hemocyanin was found to be stable up to 80 C, the hemocyanin of Maja squinado denatured at 72 C. Fluorescence measurements of the two arthropodan hemocyanins showed that their tryptophan residues are located not only in a hydrophobic environment of the internal regions of the subunits but also at the contact areas between the SUs and were exposed on the surface after dissociation. For further characterization, the structural subunits were N-terminally sequenced and the results compared with the SU sequences of other arthropods. For the SUs of Homarus americanus and Maja squinado high homologies to SU sequences of the same species, but also to those of others were found.