Neurotrophine und aktivitätsabhängige synaptische Plastizität: Untersuchungen zum Ort und Mechanismus der regulierten Neurotrophin-Freisetzung in adenoviral transduzierten hippokampalen Primärkulturen

Abstract

Eine modulatorische Rolle von Neurotrophinen (NT) in Prozessen aktivitätsabhängiger synaptischer Plastizität wurde in zahlreichen Untersuchungen gezeigt. NT bewirken diese Effekte über prä- und postsynaptische Mechanismen. Ein Ziel dieser Arbeit war es, die NT-Verfügbarkeit zu definierten Zeiten und an definierten Orten zu untersuchen, und die zugrundeliegenden Mechanismen aufzuklären. Um NT reproduzierbar nachweisen zu können wurden sie mittels adenoviraler Vektoren oder Sindbisviren überexprimiert. Für eine Transduktion dissoziierter Neuronen wurden Adenoviren bevorzugt, da Neuronen ohne zytotoxische Effekte Transgene bis zu zwei Wochen exprimieren konnten, während für einen lokalen Gentransfer in hippokampale Schnittkulturen die Verwendung von Sindbisviren erfolgreicher war, da sie selektiv Neuronen transduzieren. Im zweiten Teil der Arbeit wurden die Orte der NT-Freisetzung mit ultrastrastruktureller Auflösung identifiziert. Dazu verwendeten wir NT6myc, welches spezifisch an die Heparansulfatproteoglykane der Zelloberfläche bindet und sofort nach seiner Freisetzung an der Oberfläche adheriert, und mittels immunogoldzytochemischer Methoden nachgewiesen wurde. Die KCl-induzierte NT6myc-Freisetzung erfolgte vorwiegend aus neuronalen Ausläufern. Allerdings konnte keine ortsspezifische Freisetzung entlang der Ausläufer nachgewiesen werden. Weiterhin wurden die Speicher- und Freisetzungskompartimente von NT charakterisiert. Alle untersuchten NT waren in hippokampalen Neuronen gleich verteilt: die Immunoreaktivität war im Soma akkumuliert und homogen in punktförmigen Strukturen über die neuronalen Ausläufer verteilt. Auf EM-Ebene wurde die NT in glatten Membranstrukturen unterschiedlicher Formen und Größen lokalisiert. Im letzten Teil der Arbeit wurden NT mit definierten elektrischen Stimuli freigesetzt, um einer physiologischen Stimulation näherzukommen und eine bessere zeitliche Auflösung der Stimulation zu erreichen.

A modulatory role of neurotrophins (NTs) by pre- and post-synaptic mechanisms in processes of activity-dependent synaptic plasticity is now well established. The goal of the present study was to elucidate the spatial and temporal availability of NTs and to uncover the underlying mechanisms. In order to detect NTs in a reproducible manner, they were overexpressed by either adenoviral or Sindbis viral vectors. Adenoviruses were preferred for the transduction of dissociated neurons, since neurons expressed transgenes without cytotoxic side effects for up to two weeks. The application of Sindbis viral vectors was more successful for a local gene transfer in hippocampal slice cultures, since these transduce neurons selectively. In the second part of this study, the sites of NT secretion were identified with ultrastructural resolution. For this approach, the unique property of NT6myc to bind specifically to the heparan sulphate proteoglycans of the cell surface was exploited, since it adheres to the surface of neurons immediately after its release, where it can be detected by immunogold cytochemical methods. The KCl-induced NT6myc secretion mainly occurred from neurites. However, a site-specific secretion along neuritic substructures was not observed. Additionally, the storage and release compartments of NTs were characterised. All examined NTs were equally distributed in hippocampal neurons: the immunoreactivity was accumulated in the soma and homogeneously distributed within the neurites in a patchy pattern. At the EM level, NTs were localised in smooth membrane structures of different shapes and sizes. In the final part of this study, NT secretion was triggered by defined electrical stimuli in order to approach physiological stimulation patterns more closely, and to attain a higher temporal resolution of the stimuli.