Optimierung eines Fluoreszenz-Immunosensors für den flexiblen Multianalyt-Nachweis

Abstract

In der vorliegenden Arbeit sollte ein Fluoreszenz-Immunosensor entwickelt und optimiert werden, um einen simultanen Nachweis verschiedener Pestizide in Wasser zu ermöglichen. Durch eine neue Methode der Transducermodifikation sollte außerdem ein automatischer Wechsel der Analyten realisiert werden. Um diese Ziele zu erreichen, wurde die spezifische immunologische Analyterkennung durch Antikörper mit Fluoreszenzdetektion kombiniert. Das Transduktionsprinzip basierte dabei auf total internal reflection fluorescence (TIRF). Farbstoffmarkierte Antikörper binden auf einer chemisch modifizierten Transduceroberfläche und werden dort im evaneszenten Feld des total reflektierten Laserstrahls angeregt. TIRF bietet ein großes Potential für Multianalyt-Detektion. An jeder Reflexionsstelle kann eine andere Substanz detektiert werden, wenn die Transducer dementsprechend ortsaufgelöst modifiziert sind. Dies wurde mit einem piezoelektrischen Mikrodosierer realisiert, mit dem ein konjugiertes Aminodextranhydrogel aufgetragen wurde. Mit parallelen immunologischen Bestimmungen von je drei Pestiziden konnten die Multianalyt-Fähigkeiten des Sensors demonstriert werden. Die Nachweisgrenzen erreichten dabei Werte, die die gesetzlichen Anforderungen übertreffen. Mit Hilfe eines sogenannten Hilfssystems aus Antigenen/ Antikörpern bzw. komplementären Oligonukleotiden konnte die Idee des automatischen Analytaustauschs realisiert werden. Eine Komponente des Hilfssystems wird immobilisiert, die zweite mit Analytderivaten konjugiert und den Proben zugesetzt. Es zeigte sich, daß die Oligonukleotide sich besonders gut für eine flexible Oberflächenmodifikation und den Wechsel von Zielanalyten im Durchfluß eignen. Mit dieser Methode konnten zwei mal zwei Pestizide auf nur einem Transducer erfolgreich detektiert werden.

The aim of the presented work was to develop and optimise a fluorescence immunosensor for simultaneous detection of different pesticides in water. A new technique for transducer modification was introduced to realise an automatic change of the target analytes. To reach these goals, the specific immunological analyte recognition with antibodies was combined with fluorescence detection. The transduction principle was based on total internal reflection fluorescence (TIRF). Antibodies are labelled with dye molecules and attach to the chemically modified transducer surface. There they are excited in the evanescent field of the totally reflected laser beam. TIRF has a great potential for multianalyte detection. If combined with a spatially resolved transducer modification, at each laser reflection spot another analyte can be detected. To modify the transducer a conjugated aminodextran hydrogel was immobilised by a piezoelectric microdrop dispenser. The parallel determination of different groups of three pesticides demonstrated the multianalyte capabilities of the sensor. Limits of detection were lower than required by legislation. The application of a so called auxiliary system with antigens/ antibodies or complementary oligonucleotides allowed to realise the idea of automatically changing the analytes. One component of the auxiliary system is immobilised at the surface, the second is labelled with an analyte derivative and added to the water samples. It was demonstrated that oligonucleotides are especially useful to create this flexible surface chemistry. By this means the same transducer was successfully applied to detect two sets of two different analytes.