Expression und Funktion von G alpha i-Proteinen in Entzündungszellen

Abstract

Die Pertussistoxin-sensitiven G alpha i-Proteine sind die quantitativ am häufigsten vorkommenden G-Proteine in Säugetierzellen. G alpha i 2 und G alpha i 3 als peripher exprimierte Mitglieder der G alpha i-Familie kennzeichnen sich durch ein überlappendes Expressionsprofil und eine hohe Aminosäuren-Sequenzidentität aus. Zahlreiche vorherige Befunde lassen vermuten, dass sie sowohl Isoform-spezifische als auch redundante Funktionen besitzen. Als ein Mechanismus der funktionellen Redundanz wird die kompensatorische Hochregulation verbleibender Isoformen bei gleichzeitig genetischer Inaktivierung einer spezifischen G alpha i-Isoform vermutet. Die Befunde aus der Literatur sind hierzu widersprüchlich. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass es sowohl in der Lunge als peripherem immunologischen Gewebe und in verschiedenen Entzündungszellen zu einer Hochregulation kommt. So wurde eine signifikante Hochregulation von G alpha i3 in G alpha i 2-defizienten Lungen beobachtet. Im Gegensatz dazu blieb die Expression von G alpha i 2 in G alpha i 3-defizienten Lungen unverändert. Zusätzlich wurden neutrophile Granulozyten und Makrophagen aus der Peritonealflüssigkeit nach einer Thioglykollat-induzierten Peritonitis untersucht. Diese Zellen zeigen eine deutliche Hochregulation der noch anwesenden Isoform. Außerdem ergab die Analyse der G beta-Isoformen, eine signifikante Reduktion beider Isoformen G beta 1 und G beta 2 in den G alpha i 2-defizienten Makrophagen, während in den G alpha i 3-defizienten Neutrophilen die G beta 1-Isoform stärker exprimiert ist. Bei der Zellgewinnung nach der Peritonitis wurde festgestellt, dass sowohl die neutrophilen Granulozyten als auch die Makrophagen in den G alpha i 2-defizienten Mäusen stark reduziert sind. Um die Ursache der reduzierten Migration in einem Zellsystem untersuchen zu können, wurden mittels shRNA-Plasmide eine G alpha i 2-defiziente Makrophagen- und eine Endothel-Zelllinie in Kooperation mit Prof. Gessner hergestellt. Diese Zelllinien wurden ebenfalls auf ihre Expression der G alpha i- und G beta-Isoformen analysiert. Die Effizienz der Herunterregulation beträgt in den RAW 264.7 Makrophagen 60% und in den fEnd.5 Endothelzellen 75%. Interessanterweise kommt es nur in den Endothelzellen zu einer Hochregulation von G alpha i 3. Parallel dazu war die Reduktion beider Gbeta-Isoformen in den Endothelzellen stärker als in den Makrophagen. Diesen Ergebnissen zufolge kommt es in einem globalen G alpha i knock-out Modell meistens zur kompensatorischen Hochregulation der noch vorhandenen Isoform. Dieses Phänomen könnte mit verschiedenen methodologischen Verfahren vermieden werden. Eine Möglichkeit stellt die Analyse konditional-defizienter Tiere dar. In diesen Tieren kann das Protein von Interesse mit Hilfe des lox-Cre Systems in einzelnen Geweben und Zellen spezifisch ausgeschalten werden. In weiteren Untersuchungen muss gezeigt werden, dass eine Hochregulation und mögliche Kompensation der noch verbliebenen Isoform ausbleibt. G alpha i 3-defiziente Tiere zeigten eine vergleichbare Anzahl neutrophiler Leukozyten und Makrophagen zu Wildtyp Tieren, die in dem Modell der Thioglykollat-induzierten Peritonitis normal rekrutiert werden konnten. In vorangegangenen Untersuchungen der Arbeitsgruppe wurde beobachtet, dass G alpha i 3 in der Ausbildung der Autophagosomen beteiligt ist. Ein Infektionsmodell, in dem die Autophagie eine wesentliche Rolle spielt, ist die L. monocytogenes Infektion. Daher wurden murine embryonale Fibroblasten (MEFs) in vitro mit L. monocytogenes infiziert. Dabei wurde beobachtet, dass G alpha i 3-defiziente MEFs im Vergleich zu G alpha i 2-defizienten und Wildtyp Zellen eine wesentlich größere Permissivität für das Eindringen und die Replikation der Bakterien zeigten. Des Weiteren konnte im Gegensatz zu den Wildtyp MEFs keine Kolokalisation mit dem Autophagosomen-Marker LC3 gefunden werden. Nachfolgend wurden G alpha i 3-defiziente und Wildtyp Tiere mit L. monocytogenes infiziert. Das Überleben der G alpha i 3-defizienten Tiere ist nach der Innokulation einer LD50 Dosis stark vermindert. Dies geht mit einer erhöhten Kolonienzahl in Milz und Leber einher. Das Ganze spricht für eine essentielle Rolle von G alpha i 3 in der Immunabwehr gegen ein Bakterium, dass ein Target für die zelluläre Autophagie darstellt. Um die Mechanismen der Regulation der autophagischen Proteolyse durch G alpha i 3 während einer bakteriellen Infektion aufzuklären, sind weitere in vitro und in vivo Untersuchungen notwendig. Mit Hilfe von in vitro Analysen könnte die Regulation des Autophagosomen-Markers LC3 durch G alpha i 3-spezifische Mechanismen bestimmt werden. Weitere in vivo Infektionsversuche müssen eine protektive Rolle von G alpha i 3 sowohl in Zellen des angeborenen als auch des adaptiven Immunsystems bei infektiöse Krankheiten näher analysieren.

The pertussis toxin-sensitive G alpha i proteins are quantitatively the most abundant G proteins in mammalian cells. G alpha i 2 und G alpha i 3 as members of the G alpha i family expressed on the periphery display overlapping expression patterns and a high percentage of amino acid sequence identity. Previous studies have shown that they have redundant as well as isoform-specific roles. One possible mechanism underlying the functional redundancy is the compensatory up regulation of the remaining G alpha i isoforms when one specific G alpha i isoform is genetically de-activated, but the previous data from the literature on this subject are contradictory. In this present work it was shown, that in the lung, as a peripheral immunological organ as well as in different cells of the innate immune system a compensatory up regulation of the present isoform takes place. A significant up regulation of G alpha i 3 was observed in G alpha i 2-deficient lungs. On contrary, the expression of G alpha i 2 in G alpha i 3-deficient lungs was unchanged. Additionally, neutrophilic granulocytes and macrophages were isolated from the peritoneum after thioglycollate-induced peritonitis, and these cells were also analyzed for the expression levels of G alpha i 2 and G alpha i 3. There was a significant up regulation of the present isoform in both analyzed cell types. Moreover, the analysis of the G beta isoforms showed a significant reduction of both G beta 1 and G beta 2 in the G alpha i 2-deficient macrophages, whereas in the G alpha i 3-deficient neutrophils G beta 1 was up regulated. The cell counts of the peritoneal lavage fluid showed reduced numbers of both peritoneal neutrophils and macrophages in the G alpha i2-deficient mice. In order to investigate the causes behind this reduced migration in a different cellular system, G alpha i 2-deficient macrophages and an endothelial cell line were generated with shRNA plasmids, in co-operation with the group of Prof. Gessner. These cell lines were also analyzed for the expression levels of G alpha i and G beta isoforms. The efficiency of the G alpha i 2 knock-down with this approach resulted in a reduction of its protein levels by 60% in the RAW 264.7 macrophages and by 75% in the fEnd.5 endothelial cells. Interestingly enough, this resulted in a compensatory up regulation of G alpha i 3 only in the endothelial cells, which also showed a stronger reduction of both G beta isoforms. According to the results, in a global G alpha i knock-out model there is a compensatory up regulation of the present isoform on protein level. This phenomenon can be avoided with different methodological approaches. One possibility is the analysis of conditional deficient animals, in which the protein of interest is knocked-down in single tissues and cells with the help of the lox-Cre system. In following experiments it should be shown that in this case a compensatory up regulation of the present isoform does not take place. G alpha i 3-deficient animals do not differ from their wild type littermate controls as far as the cell count of peritoneal neutrophils and macrophages is concerned, as these cell populations could be efficiently recruited to the peritoneum in the model of thioglycollate-induced peritonitis. Previous data from our group showed a role of G alpha i 3 in the formation of autophagosomes. Due to the fact that autophagy also plays an important role in the infection model with the bacterium L. monocytogenes, mice embryonic fibroblasts (MEFs) were infected in vitro with this bacterium, which resulted in a much higher permissiveness of G alpha i 3-deficient MEFs for the invasion and replication of Listeria bacilli in comparison to G alpha i 2-deficient and wild type MEFs. Additionally, no co-localization with the autophagosome marker LC3 could be detected in G alpha i 3-deficient MEFs in comparison to the wild type cells. Consecutively, G alpha i 3-deficient and wild type animals were infected with L. monocytogenes. The survival rate of the G alpha i 3-deficient animals after inoculation of the LD50 dose was strongly reduced. This was followed by an increase in the bacterial colony-forming units in the spleen and liver of the infected animals. Hereby plays G alpha i 3 an essential role in the immune response against a bacterium which is also a target organism for the cellular autophagy. In order to decipher the regulation of the autophagic proteolysis by G alpha i 3 during a bacterial infection, further in vitro and in vivo analyses would be of great importance. With the help of in vitro approaches the regulation of the autophagosome marker LC3 by G alpha i 3 could be clarified, whereas in vivo infection experiments should help to elucidate its protective role in the cells of the innate as well as the acquired immune system during infectious diseases.