Evaluation des Cytochrom P450-Enzymsystems und anderer leberzellspezifischer Funktionen im Rahmen eines Leberersatzverfahrens

Abstract

Das akute Leberversagen und das akute Leberversagen auf dem Boden einer chronischen Leberinsuffizienz stellen eine vitale Bedrohung für den betroffenen Patienten dar. Um angesichts der Knappheit an Spenderorganen den Ausfall der Leberfunktion bis zur Regeneration zu überbrücken wurde von der Arbeitsgruppe ein zellbasiertes Leberersatzverfahren entwickelt. Auf der Suche nach einem schnell einsatzfähigen zellbasierten Leberersatzverfahren wurde in dieser Arbeit der Einfluss der Kryokonservierung auf leberzellspezifische Aktivitäten von Hepatozyten in vitro untersucht. Zunächst wurde die Bestimmung der EROD- und ECOD-Aktivität als Marker für die CYP-450-Aktivität im Labor etabliert und diese in Monolayerkulturen mit frisch Präparierten Ratten- und Schweine-, sowie mit kryokonservierten Schweineleberzellen gemessen. Dabei zeigten alle Versuche während der Versuchsdauer von 3 Tagen eine rückläufige EROD- und ECOD-Aktivität, die leicht über den in der Literatur beschriebenen Aktivitäten lag. Nebenbefundlich zeigte sich eine Inhibition der EROD und der ECOD durch das jeweils gegenseitige Substrat mit einer Aktivitätsreduktion um bis zu 60%. Der Zellverlust durch die Kryokonservierung betrug ca. 75%. Diese wiesen eine ca. 21% niedrige EROD- und ECOD-Aktivität auf. Im zweiten Schritt wurde versucht, die Ergebnisse auf das von der Arbeitsgruppe entwickelte Leberersatzverfahren, in in-vitro Versuchen mit nativ präparierten und kryokonservierten Schweineleberzellen zu übertragen: Durch die Kryokonservierung kam es zu einer Minderung der CYP-450-Aktivität um das etwa achtfache, einem fast vollständigen Verlust der Funktion des Harnstoffzyklus, sowie einer deutlichen Einschränkung des Kohlenhydratstoffwechsels. Vier Stunden nach dem Auftauen waren sämtliche hepatozytenspezifischen Funktionen quasi erloschen. Aktuell lässt sich mit dem getesteten System in Teilbereichen, insbesondere CYP-450- und Kohlenhydratstoffwechsel eine ausreichende Funktion erzielen. Durch die Kryokonservierung kommt es zu einem relevanten Verlust der hepatozytenspezifischen Funktionen. Da für die zeitintensive Zellpräparation jedoch in der Akutsituation keine Zeit bleibt, sind konservierte Zellen notwendig. Dass die Kryokonservierung sich hierzu prinzipiell eignet, konnte in den Zellkulturversuchen gezeigt werden. Das hier getestete Verfahren zur Kryokonservierung für das von der Arbeitsgruppe entwickelte Leberersatzverfahren eignet sich dazu jedoch nicht.

Acute and acute on chronic liver failure are life threatening events which can be cured by liver transplantation. Regarding the shortage of donor organs, a bioartificial liver support system (BAL) was developed in the laboratory. On the way to a quickly applicable BAL hepatocyte conservation strategies are required. In this thesis, influence of cryopreservation on specific hepatocyte functions were evaluated. First,CYP-450 dependent ethoxyresorufin- und ethoxycoumarindeethylase (EROD und ECOD) acitivity was determined in direct und cryopreserved primary rat and porcine hepatocyte mono-layer cell culture showing declining acitivity during observation time of three days, slightly higher than acitivities reported in literature. Cryopreservation caused a cell loss of 75%. Remaining hepatocytes showed a ca 21% reduction of EROD- and ECOD-acitivity to non cryopreserved hepatocytes. Subsequently, hepatocyte specific functions of native and cryopreserved BAL were determined in vitro circulation experiments. Cryopreservation led to a eight fold reduction of CYP-450 dependent ECOD-activity, almost complete loss of urea synthesis and a high grade impairment of carbohydrate metabolism. Four hours after defreezing, almost no liver specific functions were detectable. With the tested BAL, a sufficient acidity is achievable in some functions (CYP-450 and carbohydrate metabolism) with native hepatocytes. The tested cryopreservation procedure caused non tolerable high grade cell loss and impairment of liver specific functions.