Mechanismen der intrinsischen Cisplatinhypersensitivität bei der testikulären Keimzelltumor-Linie NTERA-2D1

Abstract

Mit Einführung von Cisplatin gelang ein Durchbruch in der Therapie testikulärer Keimzelltumore, deren Heilungsrate auf über 80% gesteigert werden konnte. Die Ursache der Hypersensitivität von Hodenkarzinomen gegenüber Cisplatin ist bis heute nicht abschließend geklärt, für die Medizin jedoch von hohem Interesse, da hieraus möglicherweise neue Ansätze für die Therapie anderer Tumorentitäten gewonnen werden könnten. In der vorliegenden Arbeit konnte die hohe Sensitivität der testikulären Keimzelltumorlinie NTERA-2D1 bestätigt sowie die rasche Induktion eines mitochondrialen Caspase-abhängigen Zelltodes gezeigt werden. Eine extrinsische Aktivierung der Apoptose war hier nicht beteiligt. Allerdings scheint eine Beteiligung von zytoplasmatischem p53 möglich. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass die NTERA-2D1 zur Reparatur Cisplatin-induzierter Schäden in der Lage ist, wenn sie durch Hemmung der Caspasen-Aktivität am frühen Zelltod gehindert wird. Zur Untersuchung der molekularen Mechanismen wurde die NTERA-2D1 für 48h mit Retinolsäure behandelt (NTERA-2D1+RA), wodurch eine Differenzierung eingeleitet und ein Sensitivitätsunterschied von 1 log-Stufe erreicht wurde. Verschiedene für Reparatur, Schadenserkennung und Apoptose relevante Proteine wurden vergleichend untersucht, wobei für XPC, XPA, ATM und CHK1 keine Unterschiede gefunden wurden. Leicht erhöht in der NTERA-2D1 im Vergleich zur andifferenzierten Linie war CHK2. p53 wurde in der NTERA-2D1 früher induziert und aktiviert. Bei den p53-Targetgenen war vor allem für das Genprodukt von PMAIP1, dem proapoptotischen NOXA, eine deutlich stärkere Induktion in den undifferenzierten NTERA-2D1 festzustellen. Weiter wurden p53-Cofaktoren untersucht, die die Funktion von p53 Richtung Apoptose (ASPP1, ASPP2) oder Zyklusarrest (iASPP) lenken können. Die Expression von ASPP1 war in der NTERA-2D1 deutlich höher als in der NTERA-2D1+RA. Insgesamt scheint p53 in seinen Funktionen als proapoptotisches Protein im Zytoplasma und als Transkriptionsfaktor eine wichtige Rolle für die Hypersensitivität zu spielen. Die Bedeutung der BCL-2-Proteine (z.B. NOXA) sollte näher untersucht werden, um die zellspezifische p53-Wirkung besser zu verstehen und hieraus gegebenenfalls neue Therapieansätze zur Modulation der Sensitivität resistenter Tumore gegenüber Chemotherapeutika zu entwickeln. Im letzten Teil der Arbeit wurde die Bedeutung von Ko-Medikationen zur Cisplatingabe untersucht. In einer Substanzbibliothek mit 1120 Medikamenten konnten nur wenige Substanzen mit protektivem bzw. synergistischem Effekt identifiziert werden. Eine weitere Untersuchung dieser Substanzen scheint sinnvoll, da eine entsprechende (Haus-) Medikation des Patienten während Chemotherapie einen entscheidenden Einfluss auf das Therapieergebnis haben könnte.

The introduction of Cisplatin was a breakthrough in the therapy of testicular germ cell tumours, whose cure rate could be raised to more than 80%. The cause of the hypersensitivity of testicular cancer towards Cisplatin is still not fully resolved, yet of great interest for oncology in general, as new possibilities for the therapy of other tumour entities may be explored. The present work confirms the high sensitivity of the testicular tumour cell line NTERA-2D1 as well as the rapid induction of a mitochondrial Caspase-dependent cell death. An extrinsic activation of apoptosis was not involved. However, a participation of cytoplasmatic p53 seems possible. Further, it was shown that NTERA-2D1 is capable to repair Cisplatin-induced damage if an early cell death is prohibited by blocking the Caspase activity. In order to investigate the molecular mechanisms, NTERA-2D1 was treated with all-trans retinoic acid for 48h (NTERA-2D1+RA), which induces a differentiation and a sensitivity change of 1 log step. Various proteins relevant for repair, damage detection and apoptosis were investigated in both strands, as no difference was found for XPC, XPA, ATM and CHK1. In contrast, CHK2 was slightly increased in NTERA-2D1 compared to the differentiated strand. In NTERA-2D1, p53 was induced and activated earlier. Among the p53 target genes, it was predominantly the product of PMAIP1, i.e. the pro-apoptotic NOXA, which showed a notably stronger induction in un-differentiated NTERA-2D1. Further, several p53-cofactors were investigated that modulate the function of p53 towards apoptosis (ASPP1, ASPP2) or cell cycle arrest (iASPP). The expression of ASPP1 was significantly greater in NTERA-2D1 than in NTERA-2D1+RA. All evidence indicates that p53 plays an important role as a pro-apoptotic protein in the cytoplasm and as a transcription factor for hypersensitivity. The importance of the BCL-2 proteins (e.g. NOXA) was investigated to understand the cell-specific action of p53 and develop new therapy approaches for the modulation of the sensitivity of resistant tumours. Finally, the importance of co-medications together with Cisplatin was evaluated by means of a substance library with 1120 agents, of which only a few substances with protective or synergistic effect could be identified. A further investigation of these substances appears promising, since a specific medication of the patient during chemotherapy could have a significant influence on the therapy outcome.