Untersuchungen zum Nachweis der Hepatitis A Virus RNA in menschlichen Seren

Abstract

Einleitung: Ziel dieser Arbeit war es, ein einfaches Verfahren zu entwickeln, um Hepatitis A Viren (HAV) in Patientenseren anzureichern. Eine weitere Aufgabe war es, in diesen Seren mittels RT/PCR und zwei verschiedenen Primerpaaren HAV-RNA nachzuweisen. Nach Nachweis und Anreicherung von HAV sollten MRC-5 Zellen infiziert werden, um das Virus aus den Seren anzuzüchten.

Ergebnisse: Es wurden 15 verschiedene Seren von Patienten mittels RT/PCR untersucht, die mit Hepatitis A infiziert waren. Von den untersuchten 15 Seren war ohne Anreicherungsverfahren durch Zentrifugation nur ein Serum in der nested PCR positiv. Nach Zentrifugation von je 200 µl Serum bei 4 Grad C und 12000rpm für drei Stunden zeigte sich ein Serum bereits in der ersten Runde positiv und sieben der untersuchten Patientenseren waren in der nested PCR positiv. In dieser Arbeit wurden zudem zwei Primerpaare, die beide Abschnitte in der 5’ Region der Hepatitis A Virus RNA amplifizieren, miteinander verglichen. Nicht nur Patientenseren wurden mit diesen verschiedenen Primerpaaren untersucht, sondern auch verschiedene Chargen inaktivierter Hepatitis A Virus Pools. Die aus den 4 inaktivierten Hepatitis A Virus Pools extrahierte HAV-RNA ließ sich mittels RT/PCR sicher mit den Primern N537/P452 amplifizieren, während unter Verwendung des Primerpaares N848/P66 nur die Hepatitis A Virus RNA von einem einzigen Pool amplifiziert werden konnte. Im dritten Abschnitt dieser Arbeit wurden erstmalig MRC-5 Zellen mit HAV-RNA infiziert, die aus Patientenserum extrahiert wurde, nachdem die RNA mit dem o.g. Verfahren angereichet wurde. Nach Transfektion der Zellkultur mit aus Patientenserum extrahierter RNA kam es nicht zu einer Virusanzucht. Nach Transfektion von MRC-5 Zellen mit einer ausreichenden Menge eines bereits an die Zellkultur adaptierten Virusstamms kam es zur Virusreplikation in den Zellen.

Schlussfolgerung: Positiv bei dem neu entwickelten Verfahren zur Anreicherung von Hepatitis A Viren ist die kurze Zentrifugationsdauer von drei Stunden. Zudem spricht für dieses Verfahren der Anreicherung die allgemeine Verfügbarkeit und die leichte Handhabung einer Mikrozentrifuge. Das Ergebnis der Untersuchungen der Patientenseren mit verschiedenen Primerpaaren bestätigte, dass die Durchführung einer nested PCR die Sensitivität erhöht. Das Versuchsergebnisse mit verschiedene Chargen inaktivierter Hepatitis A Virus Pools legt die Vermutung nahe, dass es durch den Prozess der Virusinaktivierung zu Veränderungen der RNA oder Veränderungen in den Bindungen an die viralen Proteine kommt. Möglicherweise wird dabei die für die RT zugängliche Virus RNA so präsentiert, dass sie sich mit der RT/PCR nachweisen lassen, wenn Primer verwendet werden, die nur einen kleinen Abschnitt der RNA amplifizieren. Die Transfektion von MRC-5 Zellen mit RNA aus Patientenseren und aus der an Zellkultur adaptierten Variante des GBM-Wildtyps zeigte, dass die Transfektion von Zellen konzentrationsabhängig ist. Gleichzeitig bestätigten diese Versuche vorhergehende Versuche zu den langsamen Wachstumseigenschaften von Hepatitis A Viren.

Objective: The aim of this study was to establish a simple method to accumulate Hepatitis A Virus (HAV) in patient’s sera. A further objective was the detection of HAV-RNA in these sera by RT-PCR with two different sets of primer pairs.After accumulation and detection of HAV MRC-5 cells should be transfected with HAV-RNA isolated from these sera in order to grow the virus.

Results: 15 different sera of patients infected with HAV were analysed by RT-PCR. Without any accumulation by centrifugation only one serum was positive after nested PCR analysis. After centrifugation of 200 µl of each sample by 4 degree C and 12000 rpm for 3 hours one sample was positive in RT-PCR and 7 samples showed a positive result after nested PCR. Additionally, the analysis were performed with two different sets of primer pairs. Both sets amplify fragments of the 5’ NCR of the HAV genome. These analyses were also carried out with different lots of inactivated HAV pools. HAV-RNA derived from 4 inactivated HAV pools was amplified with primer pair N537/P452 whereas with primer pair N848/P66 only one inactivated pool showed a positive result. In the third part of this study MRC-5 cells were infected with HAV-RNA extracted from human sera after centrifugation. After transfection of the cell culture with HAV-RNA derived from patient’s sera no viral growth could be observed. In contrast after transfection of MRC-5 cells with RNA isolated from a cell culture adapted HAV strain viral replication was detectable.

Conclusion: Centrifugation provided a suitable tool for the enrichment of HAV in human sera. RT-PCR is a fast and reliable method for the detection of HAV-RNA. The performance of a nested PCR increases significantly the sensitivity of the assay. The PCR analyses of the inactivated HAV pools suggest, that the inactivation process may cause changes in the RNA or changes of the binding of viral proteins to the RNA. Viral RNA may be presented in a way that only short fragments can be reverse transcribed and amplified by PCR. Transfection of MRC-5 cells with RNA derived from patient’s sera or with RNA isolated from a cell culture adapted HAV variant showed that the transfection of cells is dependant on the concentration of the RNA. Additionally the experiments confirmed earlier results which showed the slow growth behaviour of wild type HAV in cell culture.