In vitro-Untersuchungen zur radioprotektiven Wirkung des Bowman-Birk Proteinaseinhibitors nach Bestrahlung mit UVB

Abstract

UVB ist der energiereichste Bestandteil des Sonnenlichtes, der die Erdoberfläche erreicht. Man geht davon aus, dass die durch UVB in der DNA des Menschen induzierten Veränderungen eine wichtige Rolle bei Vorgängen wie Hauttumorinduktion oder Hautalterung spielen. Umso wichtiger ist das Verständnis und die Erforschung der molekularen Veränderungen und Reaktionen in der Zelle, die durch UV induziert werden. Eine Substanz, die dabei einen maßgeblichen Beitrag leisten kann, ist der Bowman-Birk Proteaseinhibitor. Die BBI-Präinkubation normaler Fibroblasten vor einer Bestrahlung mit UVB führte zu einem signifikant erhöhten Zellüberleben gemessen mit dem klonogenen Assay. Der radioprotektive Effekt war jedoch nur oberhalb einer Dosis von 20 J/m2 UVB messbar; unterhalb dieser Dosis wirkte BBI antiklonogen. Der radioprotektive Effekt wurde auch nach Behandlung von Massenkulturen beobachtet und zeigte sich in einer verbesserten Proliferationsfähigkeit. Der zellbiologische, radioprotektive Effekt von BBI besteht nicht darin, dass die strahleninduzierte Apoptoseinduktion reduziert wird, sondern dass die strahleninduzierte Zelldifferenzierung reduziert wird und vermehrt Zellen im proliferativen Zellkompartment bleiben. Dabei ließ sich feststellen, dass der strahleninduzierte G1-Zellzyklus-Arrest unter BBI 24 h nach Bestrahlung verstärkt nachweisbar war; gleichzeitig konnte ein erhöhter Anteil an Zellen in der S-Zellzyklusphase beobachtet werden. So kann spekuliert werden, dass der erhöhte Anteil von Zellen in der G1-Phase mit verstärkter DNA-Reparaturaktivität assoziiert ist und damit das erhöhte Überleben nach BBI-Präinkubation erklärt werden kann. Molekularbiologisch war der Effekt von BBI an die Präinkubationsphase vor Bestrahlung gebunden. In dieser Phase induzierte BBI eine Stabilisierung des regulatorisch wichtigen TP53-Proteins und eine Hochexpression des p21-Proteins. Nachfolgend kam es zur Expression der für die DNA-Reparatur essentiellen Gene ERCC3, Ligase I und TP53. Diese molekulare Reaktion vor Bestrahlung führte dazu, dass die UV-induzierten DNA-Schäden - die überwiegend durch Nukleotid-Exzissions-Reparatur behoben werden müssen - schneller behoben wurden, so dass die Zellen früher wieder in den normalen Zellzyklus zurückkehren konnten. So erlauben die Untersuchungen zum BBI Einblicke in die molekulare Reaktion der Zelle nach UVB-Bestrahlung und geben eine Substanz an die Hand, mit deren Hilfe wahrscheinlich das mutagene Potential von UVB-Strahlung abgeschwächt werden kann.

UVB radiation is the fraction of sun light with highest energy hitting earth´s surface. UVB is able to penetrate human dermis and to damage DNA of subjacent cells. Consequently, UVB can promote skin tumor formation and increase skin aging by inducing cell differentiation. However, the cell response upon UVB radiation is not understood in detail and further efforts should be undertaken to elucidate these molecular processes. In this context the Bowman-Birk proteinase inhibitor (BBI) may be helpful. BBI treatment of normal skin fibroblasts increased cellular survival following UVB irradiation, significantly. However, the radio-protective effect was detected only with doses above 20 J/m2. BBI acted as radio-protector measuring population doublings of mass cultures and colony formation of normal fibroblasts. To characterize the mode of action of BBI, we analyzed the extent of apoptosis induction following UVB irradiation. We found out, that BBI did not change extent of apoptosis, but reduced fibroblast cell differentiation. BBI pretreatment induced a more pronounced G1-phase cell cycle block associated with an increased fraction of S-phase cells at time point 24 h after UVB irradiation. Thus we hypothesize that an improved DNA-repair, due to an intensified cell cycle block, results in improved cell survival after irradiation and pretreatment with BBI. To elucidate the molecular mode of the radio-protective effect of BBI, we analyzed TP53 expression and stabilization during the pre-treatment phase with BBI. BBI treatment induced protein stabilization of the transcription factor TP53 and increased expression of p21 protein, subsequently. In addition, expression of the genes ERCC3, Ligase I and TP53 were increased also. Concomitantly, we observed a more efficient nucleotide excision repair which enables cells to reenter S-phase of cell cycle to a higher extent. In summary, results described herein, help to understand the molecular cell reaction in response to UVB irradiation and characterized BBI as a radio-protector which stimulates repair of UVB induced DNA-damages.