The Regulatory Role of Temperature and Endothelin-B Receptor in Erythrocyte Programmed Cell Death

Abstract

Suicidal erythrocyte death is regulated by a wide variety of factors such as systemic diseases, endogenous mediators, and xenobiotics. The hallmarks of eryptosis include cell shrinkage, cell membrane blebbing and phospholipid cell membrane scrambling with consequent phosphatidylserine exposure at the cell surface. It is triggered by increased cytosolic Ca2+ activity on one hand and ceramide formation on the other. Besides, the clinical relevance of eryptosis in anemia, it has been shown to be of benefit in limiting the plasmodial activity in malaria and a physiological means of averting hemolysis. In the first section of the present study, the effect of temperature on erythrocyte survival in vitro was elucidated. Fever and hyperthermia are frequently associated with anemia. In most clinical conditions they are considered as two mutually independent clinical consequences of a common cause. The present study, aims to unravel the role of excessive suicidal erythrocyte death as a cause of anemia in pyrexia related disorders. To this end, annexin V-binding was used to determine PS-exposure, forward scatter to measure cell volume, Fluo3 fluoresence to estimate cytosolic Ca2+ activity, and binding of fluorescent antibodies to determine ceramide abundance using FACS analysis. A luciferin-luciferase based assay was used to measure the cytosolic ATP concentrations. Graded hyperthermic conditions from 37°C to 41°C decreased forward scatter, stimulated annexin V-binding of human erythrocytes which was accompanied by increased cytosolic Ca2+ activity, decreased cellular ATP content and a moderate increase in ceramide formation. Hyperthermia- triggered increased annexin V-binding was significantly abrogated by the leukotriene receptor CysLT1 antagonist, cinalukast (1 µM). This study reveals that hyperthermia potentiates suicidal erythrocyte death and theoretically be one of the causes of anemia in pyrexia related disorders. In the second section, the role of endothelin B receptor stimulation in erythrocyte survival was studied. Endothelins are potent peptides with diverse physiological functions. They are known to stimulate nitric oxide formation which protects against suicidal erythrocyte death. The present study explores whether the ET1-receptor, ETB, influences suicidal erythrocyte death. To this end, cytosolic Ca2+ activity and phosphatidylserine exposure were determined using Fluo-3 fluorescence and annexin V-binding respectively, in FACS analysis. Energy depletion increased cytosloic Ca2+ activity, and phosphatidylserine exposure, effects that were significantly blunted by ET-1 and the ETB receptor-agonist sarafotoxin 6c but not by ET-2 and ET-3. ET-1 and sarafotoxin 6c significantly delayed the kinetics of suicidal erythrocyte death following energy depletion. ETB stimulation did not blunt the effect of the Ca2+ ionophore ionomycin (1 µM) on phosphatidylserine-exposure. The in vivo significance was tested using rescued ETB-knockout (etb-/-) and wildtype (etb+/+) mice. The number of phosphatidylserine-exposing erythrocytes, reticulocytes and spleen size were significantly larger in etb-/--mice than in etb+/+-mice. The etb-/--erythrocytes were more susceptible to the effect of oxidative stress and more rapidly cleared from the circulating blood than etb+/+-erythrocytes. Finally, the spleens from etb-/--mice were enlarged and contained markedly more phosphatidylserine-exposing erythrocytes than spleens from etb+/+-mice. These observations, thus disclose a novel anti-eryptotic function of ET1.

Der suizidale Erythrozytentod wird durch eine große Vielfalt von Faktoren wie systemischen Erkrankungen, endogenen Botenstoffen und Xenobiotika reguliert. Kennzeichen der Eryptose sind u.a. Zellschwund, Ausknospung der Zellmembran („Blebbing“) und als Folge der Umlagerung von Phospholipiden der Zellmembran („Scrambling“) das Erscheinen von Phosphatidylserin an der Zelloberfläche. Dies wird zum einen durch erhöhte cytosolische Ca2+ Konzentration, zum anderen durch Bildung von Ceramid ausgelöst. Neben der klinischen Relevanz der Eryptose für Anämien konnten günstige Wirkungen derselben bei der Begrenzung der Auswirkung von Plasmodien bei Malaria und bei der Abwendung schädlicher Folgen der Hämolyse gezeigt werden. Im ersten Abschnitt der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss der Temperatur auf das Überleben von Erythrozyten untersucht. Fieber und erhöhte Temperatur sind häufig mit Anämie verbunden. Im Rahmen der meisten klinischen Zustände werden sie als voneinander unabhängige klinische Folgen einer gemeinsamen Ursache betrachtet. Die vorliegende Arbeit zeigt übermäßigen suizidalen Erythrozytentod als eine Ursache von Anämie bei Erkrankungen, die mit erhöhter Körpertemperatur einhergehen. Zu diesem Zweck wurden die Annexin V- Bindung zur Bestimmung der Phosphatidylserin-Exposition, das Signal des Vorwärtsstreu-lichtes in der Durchflusszytometrie zur Messung des Zellvolumens, Fluo3-Fluoreszenz zur Einschätzung der cytosolischen Ca2+ Konzentration und die Bindung fluoreszie-render Antikörper zur Bestimmung von Ceramid mithilfe der Durchflusszytometrie eingesetzt. Mithilfe eines auf Luciferin-Luciferase basierenden Tests wurde die cytosolische ATP-Konzentration gemessen. Abgestufte Erhöhung der Temperatur auf Werte zwischen 37°C und 41°C führte zu einer Verminderung des Zellvolumens, zu einer Erhöhung der Annexin V-Bindung humaner Erythrozyten zusammen mit einem Anstieg der cytosolischen Ca2+- und Abfall der ATP- Konzentration sowie einem leichten Anstieg der Bildung von Ceramid. Die durch erhöhte Temperatur ausgelöste Annexin V-Bindung wurde signifikant durch Cinalukast, einen Antagonisten zum Leukotrienrezeptor CysLT1, vermindert. Diese Arbeit zeigt, dass erhöhte Temperatur suizidalen Erythrozytentod begünstigt und als eine Ursache von Erkrankungen, die mit erhöhter Körpertemperatur einhergehen, in Betracht gezogen werden sollte. Im zweiten Teil der Studie wurde untersucht, welchen Einfluss die Stimulation des Endothelin B-Rezeptors auf Erythrozyten nimmt. Endotheline sind wirkungsstarke vom Endothel freigesetzte Peptide mit zahlreichen physiologischen Funktionen. Es ist bekannt, dass sie die Bildung von Stickstoffmonoxid anregen, was wiederum vor suizidalem Erythrozytentod schützt. Die vorliegende Arbeit untersuchte, ob der ET1-Rezeptor ETB den suizidalen Erythrozytentod beeinflusst. Zu diesem Zweck wurden die cytosolische Ca2+ Konzentration und Exposition von Phosphatidylserin mittels Durchflusszytometrie anhand von Fluo-3 Fluoreszenz bzw. Annexin V-Bindung bestimmt. Energieentzug führte zu erhöhter cytosolischer Ca2+ Konzentration und Expression von Phosphatidylserin. Beide Effekte wurden durch Endothelin-1 und den Endothelin B-Rezeptoragonisten Sarafatoxin 6c signifikant verringert, jedoch nicht durch ET-2 und ET-3. ET-1 und Sarafatoxin 6c verzögerten signifikant den zeitlichen Verlauf des auf Energieentzug folgenden suizidalen Erythrozytentodes. Stimulierung von ETB verminderte nicht die durch das Calciumionophor Ionomycin (1µM) ausgelöste Phosphatidylserin-Exposition. Die in vivo Bedeutung wurde an ETB-transgenen- (etb-/-) und Wildtyp (etb+/+)-Mäusen geprüft. Die Anzahl an Phosphatidylserin-exponierenden Erythrozyten, Retikulozyten sowie die Größe der Milz waren in etb-/--Mäusen signifikant höher als in etb+/+-Mäusen. etb-/--Erythrozyten waren anfälliger für die Auswirkungen von oxidativem Stress und wurden schneller aus dem Blutkreislauf entfernt als etb+/+-Erythrozyten. Die Milzen von etb-/--Mäusen waren vergrößert und enthielten signifikant mehr Phosphatisylserin exponierende Erythrozyten als die Milzen der etb+/+-Mäuse. Diese Beobachtungen enthüllen eine neuartige antieryptotische Wirkung von Endothelin-1.