Identifizierung Interleukin-17 positiver Zellpopulationen bei Patienten mit rheumatoider Arthritis

Abstract

Einleitung: Die rheumatoide Arthritis (RA) ist eine systemisch-entzündliche Erkrankung deren Pathogenese von T-Zellen vermittelt wird. Seit seiner Erstbeschreibung wurde eine Beteiligung von Interleukin-17 (IL-17) an verschiedenen Autoimmunerkrankungen einschließlich der rheumatoiden Arthritis postuliert. Ziel dieser Arbeit war die Identifizierung von IL-17 produzierenden Zellen bei Gesunden und RA-Patienten und die Beschreibung des Einflußes von verschiedenen Stimulationen auf diese Zellen.

Material und Methoden: Untersucht wurden PMBC von 20 RA-Patienten und 20 gesunden Probanden. Nach Isolierung der Lymphozyten wurden diese kryokonserviert und bei Bedarf verwendet. Nach dem Auftauen wurden die Zellen mit PHA, PMA/Ionomycin, einem Peptid-Pool mit HLA Kl. II restringierten Peptiden oder Kontrollmedium für 20h Stunden inkubiert. Nach 2h Stunden erfolgte die Zugabe von Brefeldin A zur Hemmung der Zytokinsekretion. Anschließend wurden die Zellen mit den Oberflächenmarkern für CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD56 und den intrazellulären Antikörpern gegen IFN-gamma und IL-17 sowie dem Fluoreszenzfarbstoff EMA zur Identifizierung der vitalen Zellen gefärbt. Die Analyse der gefärbten Zellen erfolgte mit dem FACS LSRII. Die Auswertung und Kompensation der Messdaten wurde mit der Software FlowJo vorgenommen und die statistische Auswertung erfolgte mit der Software GraphPad Prism.

Ergebnisse: Als Hauptquelle von IL-17 konnten CD3+/CD4+ T-Helferzellen bei Gesunden und RA-Patienten identifiziert werden. Auch konnten CD3+/CD8+ und CD3+/CD4+/CD8+ doppelt positive IL-17+ Zellen beobachtet werden, wobei sich die doppelt positiven Zellen als sehr potente IL-17 Quelle sich darstellten. Darüberhinaus konnten gezeigt werden, dass auch CD3- nicht-T-Zellen eine Quelle für IL-17 darstellen. Zu diesen CD3- Zellen zählen CD4+, CD8+ und CD56+ NK-Zellen. Auch konnte gezeigt werden, dass EBV-transformierte B-Zelllinien IL-17 exprimieren. Bei CD3-/CD4+ Zellen ließ sich ein großer Anteil IL-17+ Zellen beobachten. Für diese CD3-/CD4+ Zellen ließen sich, im Gegensatz zu den CD3+ Zellpopulationen, signifikante größere IL-17 Anteile bei RA-Patienten verglichen mit Gesunden finden. Auch konnten ohne IFN-gamma/IL-17 doppelt positive Zellen bei den CD3+/CD4+/CD8+ und den CD3-/CD4+ identifiziert werden. Die Stimulation mit PMA/Ionomycin und mit PHA führte bei den CD3+ Populationen zu signifikant größeren IL-17 Anteilen verglichen mit den unstimulierten Kontrollen. Bei den CD3- Zellpopulationen hingegen führte die unspezifische PMA/Ionomycin nur bei Gesunden nicht aber bei RA-Patienten zu einem größeren IL-17 Anteil. Die T-Zell-spezifische PHA Stimulation führte bei CD3- Zellen von Gesunden und RA-Patienten zu einer signifikanten Abnahme des IL-17 Anteils. Die Stimulation mit HLA Kl. II restringierten Peptiden führte bei keiner der untersuchten Zellpopulationen zu spezifischen Veränderungen des IL-17 Anteils.

Zusammenfassung: Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass IL-17 von weiteren Zellen als nur den CD4+ Th17-Zellen produziert wird. Als besonders potente IL-17+ Zellpopulationen zeigten sich CD3+/CD4+/CD8+ doppelt positive Zellen sowie CD3-/CD4+ Zellen. Nur bei diesen CD3-/CD4+ Zellen unterscheiden sich die RA-Patienten durch einen signifikant größeren IL-17 Anteil von den Gesunden. Diese CD3-/CD4+ Zellen scheinen somit eine für die rheumatoide Arthritis relevante Zellpopulation darzustellen. Es sind weitere Studien von Nöten um diese CD3-/CD4+ Zellpopulation genauer zu beschreiben und ihrer mögliche Rolle bei RA zu identifizieren.

Objectives: Since its discovery Interleukin-17 (IL-17) has been described as a cytokine mainly secreted by T-helpers cells, so called Th17 cells. Recently data has been published discussing also other cell types capable to secrete IL-17. In this study we evaluated PMBC of 20 rheumatoide arthritis (RA) patients and 20 healthy donors in regard to the secretion of IL-17. Aim of this study was the identification of IL-17 secreting cell population and their response to different stimulations.

Methods: Lymphocytes of 20 RA-patients and 20 healthy donors have been isolated. Lymphocytes have been stimulated with PMA/Ionomycin, PHA and medium as a control for 20 h. After 2h Brefeldin A was added to block cytokine secretion. Incubation was followed by labelling with fluorescence conjugated antibodies against CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD56, IFN-gamma , IL-17 and EMA fluorescence for exclusion of dead cells. Flow cytometry was performed on a LSR II (BectonDickinson) and the results were analysed with FlowJo software. GraphPad Prism was used for statistical analysis.

Results: As the main source of IL-17 CD3+/CD4+ T-helper-cells were identified. Besides also CD3+/CD8+ cytotoxic T-cells and CD3+/CD4+/CD8+ cells stained positive for IL-17. Especially the CD3+/CD4+/CD8+ double positive showed a IL-17 fraction. Moreover CD3- cells, including CD3-/CD4+, CD3-/CD8+ cells and CD3-/CD56+ NK-cells were identified as a source of IL-17. In particular the CD3-/CD4+ population showed a large share in IL-17+ cells, being significantly higher in RA-patients compared to healthy controls. It was only in this population where significant differences between RA-patients and healthy controls could be found. Only in CD3-/CD4+ and CD3+/CD4+/CD8+ cells IFN-gamma/IL-17 double positive cells were found in unstimulated cells. After stimulation with PMA/Ionomycin and PHA CD3+ populations showed significant higher fractions of IL-17 compared to unstimulated controls. While CD3- cells of healthy controls showed a larger portion of IL-17+ cells in response to unspecific PMA/Ionomycin stimulation, CD3- cells of RA-patients didn't. In contrary T-cell specific stimulation with PHA lead to significant lower IL-17 fractions of CD3- cells compared to unstimulated controls.

Conclussion: This studied showed that IL-17 can also be secreted by cells other than CD4+ T-helper cells such as CD3+/CD8+ cytotoxic T-cells, CD3+/CD4+/CD8+ cells, CD3-/CD4+, CD3-/CD8+ cells and CD3-/CD56+ NK-cells. As populations with a high fraction of IL-17 CD3-/CD4+ and CD3+/CD4+/CD8+ cells were identified. Further studies are needed to discribe those IL-17 producing CD3- non-T-cells.