Role of Nucleotide Phosphohydrolysis and Nucleoside Signaling in Ischemic Preconditioning of the Liver

Abstract

Ischemic preconditioning (IP) represents a powerful experimental strategy to identify novel molecular targets to attenuate hepatic injury during ischemia. As a result, murine studies of hepatic IP have become an important field of research. However, murine IP is technically challenging and experimental details can alter the results. Therefore, we systematically tested a novel model of hepatic IP by using a hanging-weight system for portal triad occlusion. This system has the benefit of applying intermittent hepatic ischemia and reperfusion without manipulation of a surgical clamp or suture, thus minimizing surgical trauma. Systematic evaluation of this model revealed a close correlation of hepatic ischemia time with liver damage as measured by ALT and AST serum levels. Using different numbers of IP cycles and time intervals, we found optimal liver protection with 4 cycles of 3 min ischemia/3 min reperfusion as measured by ALT, AST, LDH, and IL-6. Similarly, ischemia associated increases in hepatic infarct size, neutrophil infiltration and histological injury were maximally attenuated with the above regimen. To demonstrate transcriptional consequences of liver IP, we isolated RNA from preconditioned liver and confirmed transcriptional modulation of known target genes (equilibrative nucleoside transporters, acute phase complement genes). Taken together, these studies confirm highly reproducible liver injury and protection by IP when using the hanging-weight system for hepatic ischemia and intermittent reperfusion.

Since the mechanisms of IP remain largely unknown, we decided to further investigate its pathways using the new HWS technique for hepatic IP. Extracellular adenosine has been implicated as an innate anti-inflammatory metabolite, particularly during ischemia, we investigated whether CD73 (ecto-5’-nucleotidase), the “pacemaker” enzyme of extracellular adenosine production, is critical for hepatic protection by IP. Using our established model, mice were subjected to four cycles of portal triad occlusion and reperfusion (3 min of ischemia/3 min of reperfusion) prior to IR or IR alone. Our results showed that hepatic IP was associated with a significant induction of CD73 transcript and protein. Targeted gene-deletion or pharmacological inhibition of CD73 abolished hepatic protection by IP as measured by LDH, AST, ALT serum levels or histological injury. Increases in extracellular adenosine with IP were significantly attenuated in cd73-deficient (cd73-/-) mice. Reconstitution of cd73-/- mice with soluble 5'-nucleotidase resulted in complete restoration of hepatoprotection by IP and hepatic injury following ischemia was attenuated by treatment of WT mice with soluble 5'-nucleotidase. Mice deficient in CD73 did not demonstrate the same degree of IP-dependent inhibition of acute phase complement gene expression/activation as did WT mice suggesting that extracellular adenosine attenuates hepatic IR via complement regulation. In summary, extracellular adenosine production by ecto-5’-nucleotidase mediates protection during murine hepatic IP. Use of soluble 5'-nucleotidase may be a potential therapeutic for hepatic ischemia.

Ischämische Präkonditionierung (IP) ist eine effektive experimentelle Technik um neue molekulare Ansatzpunkte für die Reduzierung eines ischämischen Leberschadens zu identifizieren. Als Konsequenz haben sich Studien am Mausmodell zur hepatischen IP zu einem wichtigen Forschungsbereich entwickelt. Diese sind aber technisch sehr anspruchsvoll und Details im Versuchsaufbau können die Resultate beeinflussen. Deshalb haben wir ein neues Modell der hepatischen IP entwickelt und systematisch getestet. Das „Hanging-Weight-System“ (HWS) hat im Gegensatz zu anderen Techniken den Vorteil, dass zum Setzen der intermittierenden Leberischämie keine Manipulation der Lebertrias mit einer chirurgischen Klemme oder Naht nötig ist und so mechanischer Leberschaden minimiert wird. Bei der systematischen Evaluation unseres Modells zeigte sich eine starke Korrelation der Ischämiezeit und des Leberschadens, gemessen an ALT und AST Serumkonzentrationen. Bei der Auswertung unterschiedlicher Wiederholungen der IP-Zyklen, sowie der Zeitintervalle, fanden wir eine optimale Leberprotektion mit 4 IP-Zyklen à 3 min Ischämie/3 min Reperfusion, gemessen anhand der Parameter ALT, AST, LDH und IL-6. Ebenso der ischämieassozierte Anstieg von Leberinfarktgrösse, Neutrophileninfiltration und histologischem Schaden konnte mit dem oben genannten IP-Regime maximal vermindert werden. Um den Einfluss vom IP auf die Transkription zu untersuchen, isolierten wir RNA aus präkonditionierter Leber und konnten die transkiptionelle Modulation von Zielgenen (ENTs (equilibrative nucleoside transporters), Akute Phase Komplement Gene) bestätigen. Insgesamt zeigen unsere Studien einen in hohem Masse reproduzierbaren Leberschaden und Leberprotektion durch IP bei Anwendung des HWS zur intermittierenden hepatischen Ischämie und Reperfusion. Da der Mechanismus der IP noch weitgehend unbekannt ist, war unser Ziel die zugrundeliegenden Signalwege mit dem neuen Hanging-Weight-System weitergehend zu untersuchen. Extrazelluläres Adenosin ist insbesondere im Zusammenhang mit Ischämie schon oft als körpereigener antiinflammatorischer Metabolit beschrieben worden. Wir untersuchten ob CD73 (Ecto-5´-Nukleotidase), das “Schrittmacherenzym” der extrazellulären Adenosinproduktion, eine entscheidende Rolle bei der Leberprotektion durch IP spielt. Mit dem Hanging-Weight-System und dem etablierten IP-Regime behandelten wir die Mäuse mit IP, Ischämie und Reperfusion bzw. die Kontrollgruppe mit Ischämie und Reperfusion. Unsere Ergebnisse zeigten, dass hepatische IP mit signifikanter Induktion des CD73-Transkripts sowie -Proteins assoziiert ist. Gezielte Genausschaltung bzw. pharmakologische Inhibition von CD73 verhinderten die Leberprotektion durch IP. Wir zeigten, dass die Zunahme des extrazellulären Adenosins durch IP in cd73-Knock-Out (cd73-/-) Mäusen signifikant erniedrigt war und dass die Wiederherstellung von cd73 mit löslicher 5'-nucleotidase zu einer vollständigen Wiederherstellung der Leberproduktion durch IP führte. Ischämischer Leberschaden konnte durch Behandlung von WT Mäusen mit löslicher 5'-Nukleotidase ebenfalls erniedrigt werden. Des Weiteren zeigten cd73-/--Mäuse nicht den selben Grad an IP-abhängiger Inhibition von Akute Phase Komplement Genexpression bzw. Aktivierung wie WT Mäuse. Dies weist darauf hin, dass extrazelluläres Adenosin den hepatischen Ischämie- und Reperfusionsschaden durch Komplementregulierung erniedrigt. Insgesamt haben wir gezeigt, dass die extrazelluläre Adenosinproduktion durch Ecto-5’-Nukleotidase ein wichtiger Mediator der Leberprotektion durch hepatische IP ist. Die Anwendung von löslicher 5’-Nukleotidase könnte potentiell eine therapeutische Option bei Leberischämie darstellen.