„Differentielle Regulation und subzelluläre Lokalisation verschiedener Transkripte der Serum- und Glukokortikoid induzierten Kinase 1 in vivo und in vitro“

Abstract

Die SGK1 stellt eine Proteinkinase dar, welche eine wichtige Rolle im Rahmen der Zellhomöostase durch Aktivierung von Kalium-, Natrium- und Chloridkanälen spielt. Durch Phosphorylierung des NEDD4L kommt es zu seiner Inaktivierung woraufhin verschiedenste Ionenkanäle und Transporter wie ENaC, Kv1.3 oder EAAT1 aktiviert werden. Immer häufiger konnte ihre Bedeutung als Mediator des cell survivals, durch Phosphorylierung und Negativ-Regulation des proapoptotischen FOXO3A aufgezeigt werden. Weiter zeigte sich ihre Beteiligung an der neuronalen Erregungsübertragungen, sowie der zellulären Stressantwort. Auch unter hypertensiven Bedingungen und bei der diabetischen Nephropathie kann man hohe Aktivitätslevel finden. In silico fanden wir in vergleichenden Untersuchungen zu anderen IEGs strukturelle Auffälligkeiten am 3´-Ende der SGK1-Referenzsequenz, die uns vermuten ließen, dass es möglicherweise ein alternatives 3´-Ende der SGK1-mRNA geben könnte. Durch eine Reihe von Zellkulturversuchen konnten wir die Existenz eines solchen ca. 1900bp downstream des offiziellen 3´-Endes vorkommenden Transkriptes nachweisen (SGK1-lv). Auch konnte gezeigt werden, dass es auf bestimmte Reize hin zu einer differeziellen Regulation dieses Transkriptes in Konkordanz mit Amplikons des 3´-UTR-Bereichs (SGK1 3´-UTR) und der coding sequence (cd) der Referenz-mRNA kommt. So zeigten sich unter Differenzierungsbedingungen im Laufe des Versuchs ein Expressionsabfall um den Faktor 0,25 für die SGK1-lv wohingegen es für die Variante der Referenz-mRNA (SGK1-5´) zu einem Ansteigen der Werte kam. Dieses Verhalten konnte weiter auch unter einer Stimulation mit LPS gefunden werden (Abfall der SGK1-lv um den Faktor 0,48; Ansteigen der SGK1-5´ um das 1,5-fache). Eine Kobaldchloridstimulation, sowie die Behandlung mit Noradrenalin alleine und in Kombination mit spezifischen alpha- bzw. beta-Blockern hatte hingegen keine differenzielle Regulation zur Folge. Weiter führten wir in vitro - Untersuchungen zur Abklärung der subzellulären Lokalisation der Amplikons durch. Während sich hier die Sequenzen des Referenz-mRNA-Bereichs (cds und 3´-UTR) nicht klar zytoplasmatisch bzw. nukleär lokalisieren lassen, zeigte sich das Ergebnis für die SGK1-lv klar nukleär um den Faktor 12 erhöht. In vivo - Untersuchungen der SGK1 zu einer möglichen differenziellen Regulation unter Ausdauer-Laufbelastung bzw. Hypoxie erbrachte keine signifikanten Ergebnisse. Lediglich nach 3-wöchiger Einnahme von Antioxidazien kam es für das in der Referenzsequenz liegende Amplikon (SGK1-5´) zu signifikant höheren Expressionswerten als in der Placebogruppe. Eine klare Aussage zur Bedeutung des hier erstbeschriebenen im 3’UTR-Bereich längeren Transkriptes der SGK1-mRNA konnte in dieser Arbeit leider nicht getroffen werden. Auch ist das Vorliegen von SGK1-lv im Sinne einer antisense-mRNA wie zum Beispiel für den Transkriptionsfaktor Hif1alpha beschrieben nach dem Stand unserer Versuche nicht ausgeschlossen. In silico Untersuchungen der inverted repeats im 3´-Bereich von SGK1-lv legen darüberhinaus die Ausbildung von Loop-Strukturen nahe, die nach neuen Erkenntnissen passend zu der nukleären Lokalisation der SGK1-lv sind. Ob diese Loop-Strukturen ähnlich wie die stark sequenzhomologen Loop-Strukturen der kürzlich beschriebenen Vorläufer mRNA der mCAT2 eine Zurückhaltung der mRNA im Zellkern und Ausschleusung auf einen bestimmten Reiz ermöglichen, wäre in Folgeuntersuchungen zu belegen.

The serum- and glucocorticoid-inducible kinase 1 (SGK1) represents a proteinkinase which plays an important role in cellhomeostasis by activating potassium-, sodium- and chloridechannels. Its inactivation is controlled by phosphorylation of the NEDD4L as a result of which different ionchannels and transporters such as EnaC, Kv1.3 or EAAT1 are activated. Further, its significance as a mediator of cell survival by phosphorylation and the related negativ-regulation of the proapoptotic FOXO3A could be identified more and more frequently. In addition its involvement in neuronal transmission and the cellular stress response pathways could be shown. High activation levels were also found in hypertensive conditions as well as in diabetic nephropathy. In silico investigations revealed the existence of distinctive structural features of the 3-ending of the SGK1-reference sequence in comparison to other IEGs, an observation which led to the assumption that there might exsist an alternative 3-ending of the SGK1-mRNA. By a series of cell culture experiments we could demonstrate the exsistence of such an approximately 1900bp downstream the offical 3-ending lying transcript (SGK1-lv). We could also show that definite stimuli trigger a differential regulation of this transcripte in concordance with amplicons of the 3-UTR-region (SGK1 3-UTR) as well as the coding sequence (cd) of the reference mRNA. During differentiation experiments we found a decay in the expression of SGK1-lv by a factor of 0.25 whereas the variant of the reference-mRNA (SGK1-5´) showed an increase. Similar performance was seen in stimulation with LPS (decrease of SGK1-lv by a factor of 0.48; increase of SGK1-5´ by a factor of 1.5). However stimulation with cobaltchloride and the treatment with noradrenaline alone as well as in combination with specific alpha- and beta-blockers did not result in differential regulation. To clarify the subcellular localisation of the amplicons we performed in vitro experiments. While the sequences of the reference mRNA (cds and 3´-UTR) did not show a definite cytoplasmal respectively nuclear localisation the results for the SGK1-lv were higher by factor of 12. In vivo experiments to show a possible differential regulation during endurance stress (running) or hypoxia couldn´t show any significant results. Only the intaking of antioxidants for at least 3 weeks showed a significant higher expression of the amplicon of the reference sequence (SGK1-5´) compared to the placebo group. It was not possible to make a clear statement as to the significance of the aforementioned transcript of the 3´-UTR-region. We also could not exclude the existence of SGK1-lv as an antisense-mRNA as formerly shown for the transcription factor Hifalpha. In silico investigations of inverted repeats of the 3´-region of SGK1-lv suggest the formation of loop structures. According to latest findings these structures are often found during nuclear localisation of the transcripts. In order to show that these loop structures allow a retention of the mRNA in the cell nucleus and further lead to a liberation of the abovementioned upon distinct stimuli according to the highly sequence homologue loop structures of the lately descriped precursor mRNA of mCAT2 there have to follow further experiments.