Screening differentiell hochregulierter Gene in Escherichia coli mpk mittels Differentieller Fluoreszenz-Induktion

Abstract

In Vorarbeiten konnte in Tierversuchen mit IL2-/- -Mäusen die Bedeutung der mukosalen Mikroflora für die Kolitisentstehung gezeigt werden. Hierzu wurden Mono- bzw. Ko-Kolonisierungen des murinen Darmes mit ausgewählten Kommensalen (E. coli mpk, B. vulgatus mpk) durchgeführt. Um die Mechanismen der Inhibierung der E. coli mpk–induzierten Kolitis durch B. vulgatus mpk besser verstehen zu können, wurde eine Methodik entwickelt, die die Genexpression von E. coli mpk in vivo zu erfassen vermag. Es handelt sich dabei um DFI (Differentielle Fluoreszenz-Induktion). Grundlage dieses molekularen Reportersystems ist das Plasmid pANT3, das als Vektor für ein promotorloses gfp-Gen fungiert. Eine DFI-promotor trap library für E. coli mpk, bestehend aus 15.000 DFI-Klonen, wurde erstellt. Dazu wurden DNA-Fragmente mit Längen zwischen 200 und 500 bp aus dem chromosomalen Genom von E. coli mpk direkt upstream des promotorlosen gfp-Gens in den Vektor kloniert. Zur Validierung der Methode wurde diese DFI-promotor trap library Hitzestress und pH-Stress ausgesetzt. Dabei konnte ein deutlicher Anstieg von Klasse-4-Genen (Anpassung an Umweltstress) verzeichnet werden, insbesondere wurden folgende Gene identifiziert: cydC, fkpA, lon, otsA, xasA und ynaF. In weiterführenden Versuchen wurden in Ko-Inkubation von E. coli mpk mit B. vulgatus mpk mehrere Gene identifiziert, die im Rahmen eines kompetitiven Wachstums aktiviert werden (fumB, hyfR, oraA bzw. recA, pepQ und ptsA). Die gewonnenen Daten belegen die Durchführbarkeit einer in vivo-Genexpressionsanalyse von E. coli mpk mittels DFI. Insbesondere können mittels DFI die komplexen Zusammenhänge der bakteriellen Genregulation im Rahmen von Infektionen und Kolonisierungsprozessen besser verstanden werden.

In previous animal experiments with IL-2 double knock out mice, the impact of the mucosal micro-environment on induction of Colitis could be shown. Mono- and co-colonizations of murine gut with selected commensals (E. coli mpk, B. vulgatus mpk) were conducted. To better understand the mechanisms which lead to inhibition of the E. coli mpk triggered colitis by B. vulgatus mpk, a method has been developed which has the potential of comprehending the gene expression of E. coli mpk in vivo. This method is called DFI (Differential Fluorescence Induction). As a basic construct for this molecular reporting system, the plasmid pANT3 serves as a vector for a promotorless gfp (green fluorescent protein) gene. A DFI promotor trap library for E. coli mpk has been constructed, consisting of 15.000 DFI clones. To that end, DNA fragments variing from 200 to 500 base pairs in length have been cloned from the chromosomal genome of E. coli mpk directly upstream of the promotorless gfp gene into the vector. In order to validate this method, DFI promotor trap library has been exposed to heat shock and acid conditions. During these experiments, a significant increase of class 4 genes (stress response genes) could be registered, in particular identified were the following genes: cydC, fkpA, lon, otsA, xasA und ynaF. In following experiments, co-incubations of E. coli mpk with B. vulgatus mpk were conducted, and several genes could be identified which are known to play a role in competitive growth conditions (fumB, hyfR, oraA bzw. recA, pepQ und ptsA). The aquired set of data accounts for feasibility of an in vivo analysis of gene expression of E. coli mpk via DFI. Particularly, comlex relationships of bacterial gene regulation in infection and colonization can be understood more clearly by using DFI.