Expressionsanalyse humaner Fibrochondrozyten in Zellkultur

Abstract

Viele Erkrankungen des Kniegelenks lassen sich auf eine degenerative oder traumatische Läsion des Meniskus zurückführen. Der Meniskus spielt dabei eine entscheidende Rolle für die Schockabsorbtion und Kräfteverteilung im Kniegelenk. Die Resektion nach Meniskusrissen wirkt sich beschleunigend auf die Entstehung einer Gonarthrose aus. Das Interesse am möglichst vollständigen Erhalt des Meniskusgewebes ist dementsprechend hoch. Angesichts der lediglich in der Meniskus-Peripherie vorhandenen ausreichenden Vaskularisierung sind der inneren Meniskusheilung jedoch Grenzen gesetzt.

In Anbetracht dessen sind innovative Verfahren wie das Tissue Engineering, das u. a. die Herstellung von autologen Meniskusersatzimplantaten anvisiert, in der Orthopädie von großer Bedeutung für die Zukunft. Entscheidend für die Entwicklung des Tissue Engineering beim Meniskus ist neben den biomechanischen Eigenschaften des Gewebes insbesondere die Zelldifferenzierung. Inwiefern sich Fibrochondrozyten nach der Aussaat auf Trägermaterialien von ihrem ursprünglichen Zelltypus dedifferenzieren ist schwierig abzugrenzen, da humane Meniskuszellen bisher in erster Linie morphologisch beschrieben worden sind.

Ziel der vorliegenden Studie war es, das Synthesemuster von humanen Fibrochondrozyten in Zellkultur auf anabole und katabole Komponenten sowie auf Kollagene hin auf mRNA-Ebene zu untersuchen.

Elf humane Menisken wurden nach Kollagenaseverdau in Zellkultur aufgenommen und die erste Subkultur überführt. Eine RT-PCR-Analyse erfolgte für alle Zellinien mit den Primern für die Kollagene Typ I, -II, -III, -VI und -X, die Wachstumsfaktoren VEGF, TGF-beta1, BMP-2, IGF-I und -II, PDGF, FGF-1 und -2, die matrixabbauenden Komponenten MMP-1, -3 und -13 sowie iNOS.

Die exemplarisch an drei Patientenlinien (n=3) durchgeführte immunhistochemische Färbung mit den Antikörpern für die Kollagene Typ-I und -II diente zur Bestätigung der PCR-Ergebnisse auf der Proteinebene. Zum Ausschluss von Endothelzellen in der Zellkultur kam ebenfalls der Antikörper CD11b zum Einsatz.

Die vorliegende Arbeit konnte erstmals eine Reihe von Wachstumsfaktoren in humanen Meniskuszellkulturen nachweisen, die bisher von anderen Autoren, wenn überhaupt, vorwiegend im Tiermodell mittels histologischer Gewebeuntersuchungen dargestellt worden sind. So wurde die Expression von VEGF, FGF-1 und -2, TGF-beta1, BMP-2, iNOS und MMP-3 und -13 nachgewiesen. Bei vereinzelten Proben konnte auch die mRNA von IGF-I und -II und MMP-1 detektiert werden. Vom humanen Meniskusgewebe gar nicht exprimiert wird hingegen der mitogen und chemotaktisch wirksame Faktor PDGF-AB.

Die Kollagene Typ-I und -II wurden sowohl auf mRNA als auch auf Proteinebene dokumentiert. Per RT-PCR erfolgte ebenfalls der Nachweis der Kollagene Typ-III und -VI durchgehend in allen Zellinien. Für Kollagen Typ-X konnte indessen kein PCR-Signal ermittelt werden.

Durch diese Arbeit liegt erstmals eine umfassende, über morphologische Beschreibungen hinausgehende Charakterisierung von humanen Fibrochondrozyten in Zellkultur vor.

Many disorders of the human knee joint are caused by degenerative or traumatic lesions of the meniscus. The meniscus plays a decisive role in shock absorption and load distribution in the knee joint. Resection of meniscal tears accelerates the development of gonarthrosis. Thus, the preservation of meniscal tissue is of major interest. However, considering the fact that vascularisation is concentrated to the periphery of the meniscus, endogenous healing capacities are limited.

Innovative technologies such as tissue engineering, which aim to develop autologous meniscal implants, will gain in more importance in the future of orthopaedics. Besides the biomechanical characteristics of the graft, cell differentiation will be of crucial interest. Since meniscal cells have mainly been characterised by morphological criteria as yet, a potential dedifferentiation of fibrochondrocytes on carrier tissues is difficult to determine.

The current study aims to investigate the pattern of mRNA expression of human fibrochondrocytes in regards to anabolic and catabolic components as well as collagens.

Eleven human menisci were carried to cell culture after digestion in collagenase and were subsequently transferred to first subculture. PCR analysis was performed for all cells with primers for collagens type I, II, III, VI and X, growth factors VEGF, TGF-beta1, BMP-2, IGF-I and –II, PDGF, FGF-1 and -2, and the matrix metabolising components MMP-1, -3, and -13 as well as iNOS.

To confirm the results obtained from PCR analysis on a protein level, immunohistochemistry was performed for three patients (n=3) with antibodies for collagens type I and II. Cd11b antibodies were employed to exclude incidental endothelial cells.

In the present study we were able to prove growth factors in human cell cultures, which have so far, if yet, been merely described histologically in animal tissues. VEGF, FGF-I and -2, TGF-beta1 BMP-2, iNOS and MMP-3 and-13 were revealed throughout all cultures, whereas IGF- and -II and MMP-1 were found infrequently in a small number of cultures. Interestingly, PDGF-AB, a mitogen and chemotactical active factor was found to be not expressed by human meniscal cell cultures at all.

Collagens type I and II were detected on mRNA level as well as on a protein level. Furthermore, RT-PCR disclosed collagens type III and VI throughout all cultures, but did not yield any signal for collagen type X.

For the first time, a comprehensive characterisation, which goes beyond morphological description, has been established for human fibrochondrocytes in cell culture by this present study.